برچسب: medium culture

اووا از همستر طلایی به راحتی در شرایط آزمایشگاهی در محیط کشت قابل لقاح است. از زمان این کشف گامتهای همستر توسط محققان بی شماری برای بررسی جزئیات لقاح و وقایع مرتبط با آن (ظرفیت اسپرم و واکنش آکروزوم) در شرایط آزمایشگاهی استفاده شده است. از چندین جنبه مهم سیستم لقاح همستر در شرایط ازمایشگاهی یکی از مدلهای مفیدی است که ما برای مطالعه تعامل گیمت پستانداران داریم.

بررسی موفقیت جنین دو سلولی
با استفاده از یک محیط کشت جنین مبتنی بر محلول Tyrode استفاده شده است. شواهد مورفولوژیکی باروری تقریباً ۹۰٪ تخمک های همستر تلقیح آزمایشگاهی را نشان می دهد. حداکثر ۹۰٪ تخمکهای لقاح آزمایشگاهی می توانند یک بار در کشت تقسیم شوند تا ۲ درجه تولید کنند. جنین هایی که با بررسی میکروسکوپی نوری از نظر مورفولوژیکی طبیعی به نظر می رسند. هیچ شکاف دیگری از چنین جنین ها رخ نمی دهد، از این رو ظرفیت توسعه تخمک های همستر لقاح آزمایشگاهی در محیط کشت جنین همستر را نمی توان مشخص کرد. جنینهای ۲ سلولی همستر که از زنان جفت شده بهبود می یابند نیز در شرایط آزمایشگاهی نتوانند از بین بروند. هیچ گزارشی در مورد موفقیت آمیز بودن سلول ۲ سلول همستر منتشر نشده است. یا جنین ۴ سلولی. اگر این “بلوک ۲ سلولی” از بین برود سودمندی همستر در سیستم لقاح آزمایشگاهی به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. علاوه بر این توانایی به دست آوردن توسعه کامل قبل از پیوند (زایگوت به بلاستوسیست) جنین همستر در شرایط آزمایشگاهی می تواند علاوه بر ارزشمندی از مدلهای حاضر برای مطالعه رویان شناسی اولیه پستانداران باشد.

بررسی موفقیت جنین های ۸ سلولی
جنینهای ۸ سلولی همستر کشت شده روی محیط کشت که از زنان جفت شده بهبود یافته اند ، در محلول اصلاح شده Tyrode به مرحله بلاستوسیت کشت داده می شوند ، و پیشرفت بسیار کمتری در رسانه های معمولی Kreb’s-Ringer-bicarbonate معمولی که برای جنین موش استفاده می شود انجام می شود. تعداد بسیار کمی از جنین همستر کشت شده پس از انتقال به گیرندگان ایجاد شده است. ماهیت این تفاوت مشخص نیست. شناسایی اجزای خاص محیط کشت که برای تداوم رشد جنین های همستر مهم هستند ، ممکن است اطلاعات قابل استفاده در مورد جنین سایر گونه های پستانداران را فراهم آورد ، که اغلب در مراحل موفقیت آمیز کشت از مراحل اولیه شکاف دشوار است.

کشف مدل جدید برای بررسی اولیه پستانداران

در این مطالعه جنین همستر ۸ سلولی به یک مرحله بلاستوسیست در یک محیط کشت رشد یافته برای لقاح همستر تخم مرغ رسیده است. بعضي از جنين هاي كشت شده تا مرحله بلاستوسيست كشت داده شده بودند. همانطور كه ​​توسط زايمان هاي جوان طبيعي پس از انتقال جنين نشان داده شده است. این نتایج بخشی از برنامه با هدف دستیابی به توسعه کامل قبل از پیوند جنین های همستر در شرایط آزمایشگاهی از مرحله زایگوت تا بلاستوسیست (B4) است. تکمیل این برنامه می تواند یک مدل جدید با ارزش برای بررسی رشد اولیه پستانداران فراهم کند. در اکثر آزمایش های توصیف شده در مطالعه حاضر جنین های داخل محیط کشت از همسترهای زنانه تخلیه شده به دلایل بارز اقتصادی و طراحی آزمایشگاهی بدست آمده است. اگرچه می توان ادعا كرد كه نیاز محیط برای جنین به دست آمده از این طریق می تواند متفاوت از جنین های بدست آمده از تخمك گذاری طبیعی باشد اما دلیلی بر این باور نیست كه شاید این مورد باشد. سایر محققان نشان داده اند كه تخمدان همستر فوق تخمك زده شده در داخل بدن بارور می شود و در داخل بدن از رشد عادی استفاده می شود. ویژگیهای جنین همستر را رشد موفقیت آمیز در مرحله مرحله ۸ سلولی را محدود می کند و بنابراین ممکن است برای مراحل اولیه توسعه نیز مهم باشد.

جنین های ۸ سلولی اولیه و نهایی
بارزترین ویژگی توانایی رشد افتراقی در محیط کشت جنین توسط جنین های ۸ سلولی زودرس و اواخر است. تنها ۲٪ از جنین های اولیه ۸ سلولی قادر به ایجاد بلاستوسیست در محیط غیراصولی (TALP) بودند.در حالی که ۲۲٪ اواخر ۸ سلولی بود. جنین از این نتایج استنباط می شود که تغییر مهمی در توانایی های متابولیکی جنین های پیش از بغل موش بزرگ در مرحله ۸ سلولی اتفاق می افتد. این تغییر در برخی از جنین بین ۵۴ ساعت و ۶۲ ساعت پس از فعال شدن تخم رخ می دهد. کشف ماهیت این تغییر می تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد علت بلوک توسعه مشاهده شده در مراحل جنینی قبلی در محیط کشت همستر ارائه دهد. نتایج ما همچنین نشان می دهد که پیشرفت جنین های اولیه ۸- سلول به شدت وابسته به حضور اسیدهای آمینه در محیط است. نسبت درصد جنین ها در حضور و در صورت عدم وجود اسیدهای آمینه در حال رشد ۱۸: ۱ بود.

نقش اسید آمینه در رشد جنین کشت شده

اسیدهای آمینه رشد مراحل اولیه و اواخر ۸ سلولی را به همان میزان افزایش داده است. در حضور اسیدهای آمینه در محیط کشت جنین همستر ۳۴٪ اضافی از جنینهای اولیه ۸ سلولی در مقایسه با پاسخ در محیط غیرمستقیم به بلاستوسیستها تبدیل می شوند ، و ۴۴٪ دیگر از جنین های اواخر ۸ سلولی تحت شرایط مربوطه.این مقادیر بسیار مشابه هستند. بنابراین هیچ تفاوت واقعی در پاسخهای مشاهده شده به اسیدهای آمینه از ۲ گروه جنین وجود ندارد. با توجه به تظاهرات ما از یک نیاز تا جنین ۸ سلولی اولیه به نظر می رسد که جنین برای همان اسیدهای آمینه داخل محیط کشت برای بلوغ تخمک همستر ضروری است. به نظر می رسد که مراحل متوسط ​​رشد (۱ سلولی از طریق جنین ۴ سی دی) نیز این نیاز را نشان می دهد. وابستگی به این اسیدهای آمینه ممکن است یکی از عوامل مؤثر در بلوک ۲ سلولی در رشد در شرایط آزمایشگاهی باشد. اما عوامل یا شرایط دیگر باید دخیل باشد زیرا تعداد کمی از جنین های ۴ سلولی (۴٪) که در بلاستوسیست ها در اسید آمینه تکمیل شده اند باید درگیر شوند. محیط کشت و جنینهای ۲ سلولی به هیچ وجه در این محیط شکاف ندارند. تلاش های ما برای افزایش نسبت جنین های اولیه ۸ سلولی در حال توسعه به بلاستوسیست ها با اضافه کردن مکمل ویتامین MEM Eagle به و با تغییر pH یا فشار اسمزی محیط ناموفق بودند. جنین ۸ سلولی همستر به نظر می رسد قابل تحمل به تغییرات در pH و اسمولاریته است.

مقایسه رشد جنین موش و جنین همستر در محیط کشت ها

مشاهدات فوق روی محیط کشت از چندین جنبه متفاوت از مواردی است که توسط چندین محقق گزارش شده با استفاده از جنین قبل از پیدایش اندام ها از موش که به طور گسترده به عنوان مدل برای مطالعه توسعه اولیه استفاده می شود متفاوت است. تأثیر واضح فشار اسمزی بر رشد جنین های موش در فرهنگ نشان داده شده است. با دامنه بهینه کاملاً تعریف شده. اثر برجسته pH بر رشد جنین موش توسط برینستر نشان داده شد. در محدوده بهینه برای این متغیرها جنین های موش به آسانی به مرحله بلاستوسیست در محیط کشت های شیمیایی تعریف شده ساده و حاوی BSA و منابع انرژی مناسب می رسند. یا حتی در یک رسانه متوسط ​​فاقد آمینو اسیدها و BSA. بنابراین جنین موش نسبت به ترکیبات شیمیایی محیط آن بسیار تحمل می شود. از این نظر موش ممکن است الگویی ایده آل برای ارائه اطلاعات مربوط به توسعه قبل از پیدایش اندام ها قابل استفاده برای پستانداران به طور کلی باشد. جنین های اکثر گونه های پستانداران مورد مطالعه قرار گرفته اند از جمله همستر (مطالعه حاضر)، سایر حیوانات آزمایشگاهی و گونه های حیوانات اهلی برای رشد در محیط کشت بسیار دشوارتر به نظر می رسند. در اکثر گزارش های منتشر شده ، فقط با رشد بسیار کمی جنین های اولیه این گونه ها با استفاده از انواع محیط های کشت به نظر می رسد که برای رشد جنین های موش مناسب هستند.

مطالعات فیزیولوژی فیتوپلانکتون های دریایی با توانایی ما در پرورش آنها در رسانه های مصنوعی بسیار تسهیل شده است. توسعه چنین رسانه هایی با تحقیقات پیشگامانه مایکل (۱۹۸۹-۱۹۸۳) در مورد غنی سازی مواد مغذی و با کار آلن و نلسون (۱۹۱۰) در رسانه های دریایی مصنوعی سرچشمه گرفت. این دستور العمل های رسانه های مصنوعی در دوره مدرن عمدتاً با تلاش های گیلارد ، دورپ ، مک لوگلین ، Provasoli و همکارانشان اصلاح شده است ، و اکنون قادر به حمایت از رشد اکثر جلبک های پلانکتونی هستند. بهترین و معروف ترین و پرکاربردترین دستور العمل غنی سازی مواد مغذی ، غنی سازی “f” است که به طور معمول با استفاده از نیمه مقاومت (f / 2) گیلارد و رایتر (۱۹۶۲) استفاده می شود. پیشرفت قابل توجه در توسعه رسانه های مصنوعی ، افزودن ویتامین ها و مواد کلاتی کننده به جای عصاره های خاک تعریف نشده، بود. معرفی عوامل چلات کننده مصنوعی ، به ویژه EDTA ، در رسانه های کشت جلبک توسط هاتنر (هاتنر و همکاران ۱۹۵۰) به محققان این امکان را داد تا شیمی فلزات ردیابی را تعریف کنند و اساس کلیه کارهای مدرن در زمینه فیزیولوژی فلزات ردیابی فیتوپلانکتون را فراهم می کند. با توجه به آزمایشاتی که نشان دهنده تحریک رشد فیتوپلانکتون در آبهای اقیانوسی با افزودنی های آهن است ، علاقه به ردیابی فلزات ردیابی فیتوپلانکتون دوباره احیا شده است (Subba Rao and Yeats 1984؛ Martin and Fitzwater 1988). مکانیسمهای دقیق بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی که توسط آنها فیتوپلانکتون با محدودیت فلز سازگار می شود و از آهن یا سایر محدودیت های فلزات ردیابی می شود ، مشخص نیست و نیاز به کشف است. بدیهی است که فرضیه های دقیق مکانیکی و تکنیک های جدید برای ارزیابی محدودیت فلز در دریا از آزمایش های دقیق آزمایشگاهی ناشی می شوند.

چند سال پیش گروه تحقیقاتی ما با همکاری R. R. L. Guillard محیط آبزیان تعریف شده آبزیان را برای استفاده در مطالعات فلزات ردیابی فیتوپلانکتون توسعه دادند (مورل و همکاران ۱۹۷۹). نیاز به چنین واسطه ای بوجود آمد زیرا آشکار شد که در دسترس بودن بیولوژیکی و سمیت فلزات اثرگذار با خاصیت شیمیایی آنها ، بویژه با فعالیت های یون آزاد آنها تعیین می شود (ساندا و گیلارد ۱۹۷۶ ؛ اندرسون و مورل ۱۹۷۸). بنابراین ، کنترل و دستکاری مشخصات فلزات ردیابی برای تحقیقات فلزات فیتوپلانکتون-ردیابی حیاتی بود. همانطور که ما طی چند سال گذشته میزان استفاده از فلزات ردیابی و سمیت موجود در فیتوپلانکتون های دریایی را مورد مطالعه قرار دادیم ، ما شروع به بهبود درک نظری و عملی خود در مورد کشت فیتوپلانکتون تحت انواع محدودیت های فلزی کردیم. تجربیات ما ممکن است برای دیگران که قصد مطالعه ردیابی تغذیه فلزی فیتوپلانکتون را دارند مفید باشد. هدف اول ما توصیف تغییرات پروتکل اصلی و ارائه تکنیک هایی است که اکنون در آزمایشگاه ما برای تهیه Aquil استفاده می کنیم. ما همچنین می خواهیم در مورد پیشرفت های اخیر در درک ما از شیمی متوسط ​​و اینکه چگونه این ممکن است در تحقیقات فلزات ردیابی فیتوپلانکتون تأثیر بگذارد ، بحث کنیم.

ترکیب و آماده سازی متوسط
مانند سایر رسانه های کشت مصنوعی ، Aquil از نمک های درجه رجنتس تهیه شده است ، به گونه ای ترکیب می شود که از عناصر معدنی آب دریا طبیعی بدون گلبوستوف آلی محلول ناشناخته استفاده شود. سنتز آن به سه بخش تقسیم می شود: (۱) آماده سازی چلکس ، (۲) آماده سازی متوسط ​​و (۳) عقیم سازی و دستکاری. این مراحل در تهیه Aquil در بخش های بعدی به تفصیل بیان شده است. برای از بین بردن آلاینده های فلزی غیرمستقیم موجود در مواد شیمیایی درجه تجزیه و تحلیل شونده مورد استفاده در تهیه Aquil ، جزء آب مصنوعی اقیانوس (SOW) و سایر مواد مغذی دیگر ، به استثنای غنی سازی فلزات ویتامین و EDTA ، از طریق ستون حاوی رزین تبادل یونی. رزین ، چلکس ۱۰۰ (مش ۲۰۰-۴۰۰ ؛ آزمایشگاههای Bio-Rad ، ریچموند ، کالیفرنیا) ، از یک ماتریس استایرن دیوینیل بنزن مشتق شده با ویژگی های ایمینودایستات تشکیل شده است که ترجیحاً یک کللیت را با فلزات انتقال (مثل آهن ، مس ، روی) مشتق می کنند. ، Ni ، Cd ، Co) ، در نتیجه آنها را از محلول خارج می کند زیرا محیط از طریق ستون نفوذ می کند. با این حال ، قبل از استفاده از آن ، رزین را باید با دقت درمان کرد تا مواد آلی که ممکن است از ستون خارج شود و در حالت آماده سازی جمع شود ، خارج شود. این ترکیبات به احتمال زیاد شامل ایمینودایستات رایگان بوده و بنابراین لیگاندهای اتصال دهنده فلزی قوی هستند. در حقیقت ، هنگامی که مس از ستون تازه آماده چلکس به Aquil اضافه می شود ، حضور آنالیز کننده های قوی با تجزیه و تحلیل آمپرومتری تشخیص داده می شود (شکل ۱). تصفیه بیشتر Chelex اثبات قابل اندازه گیری از این مواد اتصال دهنده فلز را از بین می برد. حضور این ماده اتصال دهنده فلز قابل جدا شدن نه تنها منحنی های تیتراسیون فلز را مختل می کند ، بلکه رشد جلبک ها را نیز مهار می کند. ما مشاهده كرديم كه در محيط Aquil تحت درمان با Chelex ناخوشايند ، كه در اصل حاوي w-zo.6 M يا ۱۰/۱۹ · ۶ M یون آزاد آهن است ، سرعت رشد Thalassiosira weissflogii به ترتيب تنها ۰٫۴۱ يا ۱٫۰۶ d-1 است.
با این حال ، هنگامی که این محیط با تابش اشعه ماوراء بنفش تابش می شود تا مواد آلی اکسیداسیون شود ، حداکثر سرعت رشد ۱٫۴۴ و ۱٫ ۸۵ d-1 مشاهده می شود. توجه كنید كه تأثیر مواد اتصال دهنده فلز در شرایط كم آهن (PFe = 20.6) برجسته تر است زیرا پیچیدگی آن در دسترس بودن آهن برای رشد را محدود می كند. برای جلوگیری از این مشکلات احتمالی ، ما یک روش شستشوی دقیق تر برای چلکس ۱۰۰ را نسبت به آنچه در دستور العمل اصلی Aquil پیشنهاد شده است ، اتخاذ کرده ایم. این پروتکل به طور موثری لیگاندهای اتصال دهنده فلز را از رزین جدا می کند (جدول ۱). ستون SOW باید بیشتر از ستون مواد مغذی تغییر یابد زیرا در گذشته ناخالصی های فلزی کمتری وجود دارد. شستشوی ۳ M NH40H در مرحله ۴ به طور هم زمان غلظت بالایی از NH4 در رزین را معرفی می کند. اگر رزین کاملاً شستشو شود ، غلظت NH4 + در آب دهنده می تواند به راحتی به سطح پس زمینه کاهش یابد (<0.1 t-tM).

محیط کشت COMBO برای تهیه یک ماده آب شیرین تعریف شده مناسب برای کشت هر دو جلبک و دافنیید ساخته شد. تعدادی از انتخاب ها در آهنگسازی COMBO انجام شد و استدلال را در اینجا شرح می دهیم. عناصر اصلی شامل هفت یون اصلی آب شیرین طبیعی (Ca2C، Mg2C ،NaC ،KC ،HCO3- ،SO4 2− و Cl−) و همچنین عناصر اصلی مواد مغذی (N ،P ،Si ،B) داخل محیط کشت می باشد. غلظت این عناصر همانند محیط گیلارد است. تفاوت در ترکیب عناصر از فراکویل به شرح زیر است: فراکویل تنها ۲۰٪ K و Na، تنها ۱۰٪ N ،۱۲٫۵٪ Si و B ندارد. اما ۲ برابر P اختلاف دارد. محیط ASM به شرح زیر است: دارای Na ،Cl و Mg بسیار بیشتر است.

مواد داخل محیط های تجاری و غیر تجاری مختلف

محیط کشت جلبک دریایی مقادیر مشابهی از Ca، دو برابر K ،P و N دارد اما فاقد مقادیر اضافی Si ،B و HCO3 – است. تفاوت آن با DYIII به شرح زیر است: DYIII دارای دو برابر Ca و یک سوم بیشتر منیزیم است اما سدیم پایین (فقط ۲۰٪) و K (فقط ۴۰٪) و مواد مغذی پایین (اما شامل Si و B) نیز دارد. محیط کشت دریایی زئوپلانکتون معمولی غلظت مواد مغذی اصلی کمتری را در مقایسه با محیط های کشت جلبکی دارند. غلظت عناصر سازنده در محیط COMBO برای کشت هر دو جلبک و زئوپلانکتون مناسب است. یک مورد مهم در ابداع محیط کشت جلبک COMBO نسبت Ca: Mg بود. بکر گزارش داد که جلبکها طیف گسترده ای از نسبت های Ca: Mg را تحمل می کنند. با این حال لیمن تعیین کرد که رشد دونوبریون سرتولاریا مطلوب است که نسبت مولی Ca: Mg 2: 1 بود. برای زئوپلانکتون نسبت مولی Ca: Mg از محیط MS برابر با ۳٫۲: ۱ و نسبت الندت و بیاز  به ۴: ۱ است که هر دو نسبت به سایر محیط کشت ها کمی بیشتر هستند. این محیط های آب سخت در اصل برای کشت Daphnia magna گونه ای سازگار برای زیستگاه های آب سخت طراحی شده بودند. همانند محیط کشت این و فراکویل نسبت مولی Ca: Mg از COMBO برابر ۱٫۷: ۱ است.

کشت دوگانه

از آنجا که محیط کشت COMBO در آزمایشگاه ما با فرهنگ D. magna و همچنین D. pulicaria و Ceriodaphnia dubia با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته است ، ما دریافته ایم که نسبت مولی Ca: Mg از COMBO برای کشت دوگانه یک مجموعه گسترده از جلبک ها و زئوپلانکتون مناسب است. در آزمایش COMBO ، محققان دیگر نیز تولید مثل بسیار خوبی را توسط Daphnia pulex ، D. pulicaria ، D. galeata mendotae ، D. lumholtzi و D. magna گزارش داده اند و مهمتر اینکه این محیط کشت ها بیش از دو سال در COMBO حفظ شده اند (S. دودسون pers. com). سایر cladocera هایی که با موفقیت در COMBO پرورش یافته اند عبارتند از Bosmina longirostris (K. Schulz pers. com) و Diaphanosoma (R. Sterner pers. com.) و علاوه بر کلادوکران ها ، آزمایشگاه ما در COMBO نیز دارای پلاتاریا و روتیفرهای مختلط است.

تاثیر های مثبت و منفی رقیق سازی محیط کشت

برخی محققان اظهار داشته اند كه محیط کشت COMBO می تواند به همان اندازه مؤثر باشد كه ۵۰٪ با آب مقطر رقیق شود (S. Dodson pers. com) اما ما این رقیق سازی بستر کشت را برای گونه های آب سخت مانند D. magna توصیه نمی كنیم. غلظت K از COMBO (3.9 میلی گرم لیتر-۱) در محیط زئوپلانکتون کیتینگ (۱۹۸۵) (۹٫۸ میلی گرم L-1) و کمی بیشتر از آن در محیط کشت ابداع شده توسط الندت و بایاس (۱۹۹۰) بسیار پایین است. ۳/۳ میلی گرم لیتر در ۱). غلظت K پایین تر را انتخاب کردیم زیرا شناخته شده است که برای زئوپلانکتون مناسب است (یعنی الندت و بایاس ۱۹۹۰) ، و به اندازه کافی زیاد نیست که برای بیشتر جلبک ها سمی باشد. با این وجود ، کسانی که مایل به رشد گلبولهای طبیعی هستند ، می توانند نتایج لمن (۱۹۷۶b) را در نظر بگیرند که دریافتند K به سمیته داینوبریون بالاتر از ۵ میلی گرم لیتر از ۱ میلی گرم سمی تبدیل شده است. . com.) این گونه قبلاً با موفقیت در محیط کشت WC با نیمی از عناصر کمیاب معمولی و ۲۵ M P (کلوونز و گیلارد ۱۹۷۵) کشت داده شد. ما همچنین در COMBO گونه های بیشماری از سیانوباکتری ها ، Cryptophytes ، جلبک های سبز و دیاتوم ها را حفظ کرده ایم. در جدول ۵ حداکثر سرعت رشد جلبکهای انتخاب شده در محیط COMBO و شرایط کشت مربوطه ذکر شده است. جلبکهای دیگر شامل Staurastrum sp. ، Diogenes sp. ، Selenastrum sp. ، Cryptomonas ovata و Cryptomonas reflexa هستند. محققان دیگر از COMBO برای رشدChlamydomonas ، Selenastrum (S. Dodson ، pers. com.) ، Scenedesmus acutus (R. Sterner ، pers. com) و Chlamydomonas reinhardii استفاده کرده اند (K. Schulz ، pers. com). COMBO ثابت شده است که یک محیط کشت عالی برای آزمایشات دستکاری مواد مغذی و جلبک و زئوپلانکتون است (کیلام و همکاران ، ۱۹۹۷a ؛ کیلام و همکاران ، ۱۹۹۷ ب ؛ اروبه و همکاران ، ۱۹۹۷). زیرا P تحویل است.

چگونه میزان عناسر محیط کشت را دستکاری کنیم؟

از آنجا که در محیط کشت میکرو جلبک P به عنوان K2HPO4 تحویل داده می شود، هنگام کاهش غلظت فسفر COMBO برای استفاده در چنین آزمایشات دستکاری توصیه می کنیم غلظت K را با KCl (جدول ۱A) تکمیل کنید. Cl اضافه شده قابل توجه نیست. به همین ترتیب ، زیرا N به طور عمده به عنوان NaNO3 تحویل داده می شود. هنگامی که COMBO برای آزمایش های کم N آماده می شود ، سطح Na نیز پایین می آید ، اما مانند Cl ، این بعید است که مشکلی ایجاد کند (Becker 1994). عناصر ردیابی محیط کشت COMBO دارای دو عنصر عنصر کمیاب متفاوت است. عناصر کمیاب جلبک (ATE) شامل EDTA ، Fe و هفت عنصر جزئی هستند. عناصر کمیاب حیوانات (ANIMATE) شامل پنج عنصر جزئی جزئی دیگر است. از نظر كمبود و مسموميت براي برخي عناصر جزء محدوده محدودي وجود دارد و مطالعات دقيق تر در اين زمينه براي جلبك هاي آب شيرين مطلوب خواهد بود. یک راه حل مناسب برای عناصر کمیاب محیط کشت باید غلظت کافی را برای جلوگیری از محدودیت در زیست توده با جلبک زیاد فراهم کند. اما در زیست توده کم به سمیت نزدیک نشود.

مزیت و مشکلات جذب فلزات توسط جلبک ها

جلبک ها می توانند فلزات را تا حد زیادی متمرکز کنند (۱۰۰۰ برابر) با این حال غلظت بالای فلز در جلبک ها می تواند برای حیواناتی که آنها را می خورند مضر باشد. بنابراین باید بین کمبود و سمیت تعادل برقرار شود. مورل مخلوط عنصر کم ردیابی فراکول را طراحی کرد تا از نظر ترمودینامیکی میزان بارش مواد جامد در محیط کشت دریایی را کاهش دهد. اگرچه شرایط تعادل ترمودینامیکی باعث بارندگی می شود. میزان آنقدر پایین است که برای اهداف عملی مهم نیست. سطح EDTA (جدول ۲) همانند WC است (۱۱٫۷ M؛ Fraquil = 5.0 M؛ ASM و DY Ill از WC بالاتر هستند؛ کیتینگ بالاتر است و الندت و بیاس پایین تر است). نسبت شلات: فلز تقریباً ۲٫۴: ۱ به عنوان ایده آل پیشنهاد شده است (کلر و همکاران ، ۱۹۸۷). غلظت آهن همان مقدار در ASM ، پایین تر از WC (35٪) است ، اما کمی بیشتر از Fraquil ، DYIII ، یا محیط کشت های Keating (MS) یا Elendt و Bias (M-4) است. غلظت انتخاب شده یک سازش است ، زیرا آهن یک عنصر اصلی سوخت و ساز بدن است ، به خصوص برای سیتوکروم ها ، سنتز رنگدانه و متابولیسم نیتروژن. هفت عنصر جزئی مورد نیاز جلبک ها (ATE) areMn ، مس ، روی ، Co ، Mo ، Se و V هستند.

تعدادی از محیط کشت های تعریف شده آب شیرین وجود دارند که برای کشت طیف وسیعی از جلبک ها بکار مفید هستند. اما برای کشت زئوپلانکتون هایی مانند دافنید ها کافی نیستند. برای انجام آزمایش ها روی روابط بین حیوانات و ارگانیسم های غذایی، گسترش بستر کشت هایی که هم رشد جلبک ها و هم رشد زئوپلانکتون را بدون نیاز به تغییر محیط کشت جلبک به صورت اختصاصی چه برای جلبک چه زئوپلانکتون، پشتیبانی کند مهم است.

انواع محیط های آب شیرین

محیط کشت های آب شیرین زیادی طراحی شده اند اما چهار عدد از آن ها بصورت گسترده در حال استفاده اند: گویی لارد، فراکویل، ASM و DYIII. اصلاحات بیشماری برای یک و چند تا از این بسترکشت ها انجام شده تا برای نیازهای خاص مناسب باشند. گروهی از محققان محیط های مصنوعی ابداع کردند که از دستور العمل های مورفی و داویدوف و کالین و پروواسولی گرفته شده اند. این محیط کشت ها برای کشت گونه های دافنی در شرایط تعریف شده برای استفاده در ازمایش های تغذیه و سم شناسی استفاده می شوند. با این حال به دلیل محتوای گلایسیل گلیسین آن ها کشت ها باید حساس باشند که این برای استفاده های روزمره غیر عملی می باشد.

محیط کشت M4

محیط کشت M4 که یک محیط آب سخت است توسط سازمان همکاری اقتصادی و توسعه برنامه های سم شناسی در اروپا تایید شده است. این بستر مخصوصا برای استفاده برای کشت D. magna مفید است اما M4 نمی تواند جلبک ها را به موفقیت حفظ کند. سازمان حفظ محیط زیست در ایالت متحده امریکا استفاده از آب دوباره تجدید شده را توصیه کرده است. چهار محیط کشت زئوپلانکتون ساده نمکی برای مطاله روی سمیت ماهی ها تولید شده است. این محیط کافی نیست چرا که فاقد عناصر ضروری می باشد. دافنی ها می توانند روی چنین محیطی با اضافه کردن آب فیلتر شده دریاچه و یا آب معدنی پریر زشد کنند اما این کار هدف از داشتن یک بستر کشت تعریف شده برای مطالعات ازمایشگاهی را خراب می کند.

محیط کشت COMBO

ما یک محیط کشت به نام COMBO تولید کردیم که رشد عالی هم جلبک ها و هم زئوپلانکتون ها را پشتیبانی می کند. دو نوع جلبک در این بستر کشت و هم چنین محیط گوییلارد کشت داده شدند و سرعت رشد آن ها با یک دیگر مقایسه شد. یکی از جلبک ها که  Ankistrodesmus falcatus بود، سپس برای تغذیه یک کلادوسران به نام Daphnia pulicaria که آن هم روی محیط کشت COMBOکشت داده شده بود استفاده شد. نتیجه باروری این زئوپلانکتون با آب های سحطی طبیعی مقایسه شد. ما هم چنین تعیین کردیم که آبا مقدار COMBO به عنوان یک مدیوم کشت برای این کلادوسران به وسیله اصلاح در لظت فسفر و یا نیتروژن تحت تاثیر قرار می گیرد یا نه تا ببنیم آیا محیط کشت جلبک و زئوپلانکتون جدید برای تحقیق های تغذیه مناسب است یا نه. نتایج ما با نتایج سایر محققان بحث شده است که با موفقیت از COMBO برای کشت استفاده کرده اند بسیاری از گونه های دیگر جلبک و زئوپلانکتون.

محیط کشت ها برای کشت جنین های انسانی در شرایط آزمایشگاهی به دور از فرمولاسیون های کشت سلولی به سمت فرمولاسیون های متوالی مرحله خاص جهت تسهیل در ارائه داروهای مختلف، اجزای تشکیل دهنده جنین در طی فعال سازی قبل و بعد از تکامل تکامل یافته اند. بسیاری از فرمولاسیون ها پی در پی تجاری برای استفاده خاص از مرحله وجود دارد و اخیراً دو فرمولاسیون محیط کشت طراحی شده اند که به عنوان یک بستر کشت واحد برای ارائه کلیه مؤلفه ها در جنین در طی تمام مراحل پس از باروری در توسعه آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می گیرند.

عوض کردن محیط کشت در طول پروسه پرورش جنین

انتقال جنین ها به داخل ظروف جدید یا تازه کردن محیط کشت جنین در فواصل زمانی به عنوان روشی برای جلوگیری از قرار گرفتن در معرض جنین ها در ساخت بالقوه آمونیوم از تجزیه اسیدهای آمینه یا ترکیبات جوی فرار پیشنهاد شده است. بستر کشت های منفرد (گاهی اوقات به عنوان بستر کشت های تک کشت) نیز گفته می شوند که برای فراهم کردن تمام اجزای جنین در همه زمان ها طراحی شده اند. یک محیط کشت مدرن تک کشت برای محدود کردن ساخت آمونیوم با جایگزینی گلوتامین با فرم پایدارتر می تواند برای کشت مداوم بدون وقفه جنین های انسانی مورد استفاده قرار بگیرد.

انتقال جنین ۳ روزه

برای انتقال جنین های داخل محیط کشت ۳ روزه جنین ها برای تعداد سلول و مورفولوژی گلزنی شدند (نمره Q1-5 ، ۱ بهترین). جنین ها در محیط متوالی سپس به محیط متوالی دوم منتقل شدند. جنین ها در محیط تک بدون تجدید میکرودروپ ها در ظرف اصلی باقی مانده بودند. انتخاب جنین برای انتقال بر اساس تعداد سلول و نمره كیفیت صرف نظر از درمان محیط کشت انسانی انجام شد. بلافاصله قبل از انتقال جنین های منتخب به تقریباً ۳ میلی لیتر ۳۶ درجه سانتیگراد کوین منتقل شدند. دلیل استفاده از این محیط برای انتقال جنین ثبات pH است که در صورت انتقال جنین بیشتر از زمان پیش بینی شده توسط بافر هپس ارائه می شود. کاتتر با حجم کمی از محیط کشت شسته شد و جنین ها در نوک سوند در حجم تقریباً ۱۵-۱۵ میلی لیتر واقع در بین دو حباب هوا کوچک آسپیر شدند. انتقال جنین با استفاده از راهنمایی سونوگرافی انجام شد. ظروف دارای جنین هایی که منتقل نشده بودند به شیشه شیشه ای برگردانده شدند که در مرحله بعد به شرح گازی شد و برای کشت به روز ۵ و / یا ۶ برای ارزیابی برای انجماد به انکوباتور برگشت داده شد (بلاستوسیست های گسترش یافته با توده سلولی آشکار).

انتقال جنین های ۵ روزه

برای انتقال جنین های محیط کشت انسانی روز ۵ جنین ها به طور خلاصه در صبح روز ۳ مشاهده شدند. اما نمرات کیفی به آنها اختصاص نیافته بود. جنین ها در محیط پی در پی به محیط متوالی دوم منتقل شدند. جنین ها در تیمار متوسط ​​تنها بدون تجدید میکرودروپ ها در ظرف اصلی باقی مانده اند. ظروف به شیشه مطابق با توضیحات گازی برگردانده شدند و برای ادامه رشد در محیط کشت تا روز ۵ به دستگاه کشت برگشت داده شدند. در روز ۵ جنین در هر دو ظرف به مرحله رشد و مورفولوژی ذهنی (نمره بلاستوسیست Q1 به Q3 ، ۱) رسید. بهترین بودن ؛ جنین هایی که دارای رشد اولیه بلاستوسل و بدون شناسایی توده سلولی درونی هستند به عنوان بلاستوسیست های اولیه بدست آمدند). انتخاب جنین در هر محیط کشت برای انتقال بر اساس نمره كیفیت بدون در نظر گرفتن كشت درمان متوسط ​​انجام شد. انتقال جنین همانطور که در بالا توضیح داده شد انجام شد. جنین هایی که برای سرمازدگی فوری انتخاب نشده اند (بلاستوسیست های جوجه کشی کاملاً گسترش یافته با توده سلولی درونی در روز ۵ تبخیر شد) به ظرف شیشه ای بازگردانده شدند. همانطور که شرح داده شد گازی شده و برای ادامه کشتدر محیط کشت تا روز ۶ و ارزیابی برای انجماد به انکوباتور بازگشتند. جنین های بارور شده در هر بیمار هر طور که به طور تصادفی به هر یک از محیط های تزریق کشت اختصاص داده شد تا از تغییرات تجربی بین بیماران کاسته شود. داده های رشدی در هر درمان (سیستم کشتی) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اما بین روز انتقال جنین با استفاده از آزمون t زوجی و آزمون رتبه قرار نگرفت. مشخصات بیمار و چرخه نتایج حاملگی و داده های رشد جنین خواهر و برادر با توجه به روز انتقال جنین در درمان محیط کشت انسانی وجود دارد.

مقایسه میانگین روزهای کشت

برای انتقال جنین سه روز کشت به محیط کشت جدید میانگین تعداد جنین های ۶ سلولی بهترین است. میانگین تعداد جنین برای انتقال از هر رسانه انتخاب شده و میانگین نمرات کیفیت جنین انتقال یافته بود. بین دو سیستم فرهنگ تفاوت معنی داری وجود ندارد. علاوه بر این تعداد جنین های فوق طبیعی در حال توسعه به مرحله بلاستوسیست برای حفظ سرمازدگی بین رسانه ها تفاوت معنی داری نداشت.

مقایسه تعداد بلاستوسیست ها در روز کشت های مختلف

در مورد انتقال جنين در روز ۵ به محیط کشت انسانی جدیدتر ميانگين تعداد بلاستوسيست ها در روز ۵ در محيط متوسط ​​در مقايسه با کشت هاي متوالي به طور معني داري بالاتر بود و تعداد قابل توجهي بالاتر از بلاستوسيست ها براي انتقال از محيط واحد انتخاب شدند. گرچه میانگین نمرات کیفیت جنین های انتخاب شده برای انتقال به محیط کشت تازه مشابه بودند. یک سیستم درجه بندی صریح تر برای بلاستوسیست ها (۱۶ ، ۱۷) ممکن است تصویری دقیق تر از روند انتخاب مشاهده شده در این مطالعه را ارائه دهد. در ۲۲ مورد از ۴۴ انتقال (۵۰٫۰٪) ۵ مورد از ۴۴ انتقال (۴/۱۱٪) از رسانه هاي متوالي فقط ۱۷ و ۴۴ مورد از ۴۴ انتقال (۶/۳۸٪) از تنها رسانه ها را براي انتقال از هر دو رسانه انتخاب كردند. میانگین تعداد بلاستوسیستهای موجود در روز ۵ در محیط کشت واحد به طور معنی داری بیشتر است. پشتیبانی از این ایده که یک رسانه واحد می تواند انجام دهد و همچنین کشتهای پی در پی. نتایج این مطالعه همچنین نشان می دهد که استفاده مداوم از یک رسانه واحد بر رشد جنین تأثیر منفی نمی گذارد. همانطور که توسط دیگران پیشنهاد شده و نشان داده شده است (۶-۹). در این مطالعه هیچ تلاشی صورت نگرفته است که به طور هدفمند از هر درمان جنین منفرد انتخاب شود بلکه بهترین جنین ها صرف نظر از درمان برای جایگزینی انتخاب می شوند. با این حال برای مطالعه بیشتر روی محیط کشت جنین احتمال استفاده از دو (یا چند) کشت متفاوت وجود دارد.

پروتکل منفرد کشت جنین

محیط کشت ها در یک پروتکل کشت جنین خواهر و برادر با اجازه دادن جنین در داخل هر بیمار به انتخاب “کدام” از بین دو بستری که ترجیح می دهند نرخ کاشت بالاتر را ارتقا می دهند. از مزایای پروتکل منفرد مداوم موفق می توان به کاهش پتانسیل برای از بین رفتن جنین و / یا معرفی آلاینده ها از طریق خطاهای دست زدن، کاهش استرس جنینی از جمله کاهش دما و نوسانات یا حتی پیپتینگ جنین اشاره کرد. گرچه کاهش در هزینه مصالح مورد استفاده از اهمیت محدودی برخوردار است. لازم به ذکر است که اگر آزمایشگاه یا محیط کشت کمتر از حد مطلوب باشد ، آزمایش مداوم بدون وقفه ممکن است کمتر موفقیت آمیز باشد ، زیرا ممکن است در طول دوره کشت ترکیبات آلی فرار و محلول در آب و یا آب حل شونده وجود داشته باشد. داده های ارائه شده در اینجا حاکی از آن است که با کنترل دقیق محیط محیط کشت ، به عنوان مثال ، با استفاده از کوزه های شیشه ای آب بندی شده ای که به اتمسفر خاص گاز مجهز شده اند ، ممکن است این نگرانی به حداقل برسد. این مطالعه نشان می دهد که هیچ گونه مزیت آشکاری در استفاده از بسترهای پی در پی بر روی یک محیط واحد وجود ندارد و محیط کشت ناشر بدون وقفه می تواند از نظر رشد جنینی و نتایج بالینی موفقیت آمیز باشد. اگر شرایط آزمایشگاهی از نزدیک مورد بررسی قرار گیرد و از اقدامات احتیاطی در برابر نوسانات جوی استفاده شود. همچنين نياز به مطالعات دقيق تري را براي به چالش کشيدن آنچه در نظر گرفته مي شود پذيرفته شود ، يا روش هاي فرهنگي جنيني سنتي باشد ، تأکيد مي کند.

نیاز به محیط اختصاصی باکتری

هدف تهیه یک محیط کشت است که از نظر فیزیولوژیکی برای باکتریهای مطلوب باشد که از نظر تجربی برای بسیاری از اهداف تغذیه ای، متابولیکی و فیزیولوژیکی مفید بوده و برای جابجایی گسترده آن به اندازه کافی مناسب باشد. به طور خاص یک محیط با خصوصیات زیر مورد نظر می باشد: (۱) غلظت هر یک از عناصر اصلی مواد مغذی محیط کشت (فسفر، نیتروژن، کربن و گوگرد) باید بطور مستقل قابل تنظیم باشد و باید با ترکیب آن در پروتوپلاسم باکتریایی در مقادیر متناسب تنظیم شود. به منظور تسهیل برچسب زدن ایزوتوپی. (ب) نرخ رشدی که توسط محیط حمایت می شود باید حداقل به همان میزان سریع باشد که توسط هر حداقل شناخته شده پشتیبانی شود. (III) محیط کشت باید از رشد تا تراکم سلولی که برای اندازه گیری های بیوشیمیایی مفید است پشتیبانی کند. (IV) باید به راحتی ساخته شود و ارزان باشد. (v) باید پایدار باشد و ترجیحاً قادر به ذخیره سازی به صورت غلیظ باشد. (vi) باید نرخ رشد قابل تکرار را بدهد. (vii) باید اندازه گیری جذب را مجاز کند. (viii) رشد سلولها باید به طور نامحدود حمایت شود و نباید به حضور پرماجرا ریز مغذی ها بستگی داشته باشد و (ix) غلظت یون هیدروژن باید به اندازه کافی بافر شود.

محیط کشت MOPS

محیط کشت MOPS که در اینجا شرح داده شده است تمام این مشخصات را برآورده می کند چند نظر در مورد ویژگی های فردی محیط به ترتیب است. سیستم بافر pH از بسیاری جهات انتخاب یک بافر مناسب مسئله اصلی در تدوین یک ماده مصنوعی برای مطالعات بیوشیمیایی روی باکتریها یا سایر میکروارگانیسم ها است. تمایل فیزیولوژیست برای دستیابی به تراکم سلولی بالا در محیط کشت تقاضای سنگین را بر روی ظرفیت بافر pH محیط قرار می دهد و مستلزم آن است که غلظت یونهای خاص به ویژه Fe2 3+ در حد pH محلول در حد محلول انحلال باشد. نمک های فسفات به دلیل داشتن pK مطلوب انتخابی کلاسیک برای بافر بوده و به دلیل داشتن یون فسفات به عنوان یک کلات فلزی یک مخزن محلول مفید یون های فلزی و همچنین این محیط کشت انتروباکتری یک منبع پرماجرا از عناصر مختلف مورد نیاز در مقادیر کمیاب را فراهم می کند. متأسفانه سودمندی برچسب زدن ۳۲p [P04] در زیست شناسی مولکولی مستلزم آن است که غلظت فسفات در زیر یک سطح که در آن یک بافر یون هیدروژن موثر است کاهش یابد. جایگزین معمول Tris بوده است اما برای بسیاری از گونه ها این ماده در غلظت های بالای مورد نیاز PK نامطلوب آن در محیط کشت سمی است. MOPS یکی از سری بافرهای آلی ساخته شده توسط Good و همکارانش برای استفاده در کارهای بیولوژیکی به دلیل داشتن pK مفید (۷٫۲ در ۲۰ درجه سانتیگراد) به جای آن در محل ترینس انتخاب شده است. وعده عدم سمی بودن و نسبتاً ارزان قیمت بود. در غلظت هایی که یک بافر رضایت بخش است هیچ اثری قابل ردیابی بر رشد ندارد.

فرمولاسیون نهایی محیط انتروباکتری

فرمولاسیون انتخاب شده برای محیط کشت در نهایت (۴۰ میلی متر؛ pH متوسط اولیه ۷٫۲ در ۳۷ درجه سانتیگراد) از رشد گلوکز در کل محدوده توصیه شده از تراکم سلولی برای مطالعات حساس فیزیولوژیکی (حداکثر تا A420 2.0) با افت فقط ۰٫۲ واحد pH پشتیبانی می کند و رشد نمایی تا A420 از ۵٫۰ با افت تنها ۰٫۵ واحد pH را امکان پذیر می کند. از آنجا كه گلوكز محیط کشت اسيد ترين ریز عنصر شناخته شده براي آنزيم باكتري است محيط كيفيت هر چه مواد تركيبات آلي محيط را داشته باشد رضايت بخش است. MOPS را نمی توان به عنوان منبع کربن، نیتروژن یا گوگرد توسط S. typhimurium استفاده کرد. گونه های E. coli که مورد آزمایش قرار گرفتیم نمی توانند از MOPS به عنوان منبع کربن یا ازت استفاده کنند اما در صورت عدم وجود سولفات اضافه شده می توانند از MOPS به عنوان منبع گوگرد استفاده کنند. این استفاده توسط سطوح پایین سولفات آزاد در محیط کشت باکتری کاملاً سرکوب می شود بنابراین برچسب زدن ایزوتوپی با ۳۵S [SO ، ۲- من هیچ مشکلی را نشان نمی دهد. تنها روشی که امکان استفاده از محیط MOPS وجود ندارد رشد سولفور محدود شده از E. coli است. برای این منظور تنها Tris را می توان با MOPS جایگزین کرد به شرط اینکه pH با دقت کنترل شود. MOPS یک یونیتور فلزی ضعیف است و از این رو از ویژگی مطلوبی برخوردار نیست که بعید به نظر برسد آلاینده های فلزی خارجی را به محیط کشت وارد کند. در عین حال در حفظ غلظت مناسب Fe2 3+ در pH خنثی مفید نیست. Tricine (6) باعث کلات Fe2 ‘3+ می شود و اضافه کردن مقدار کمی از این بافر آلی نه تنها یک مخزن رضایت بخش از آهن محلول در محیط عادی را فراهم می کند بلکه حتی امکان ساخت یک ماده غلیظ ۱۰ برابر را نیز برای استفاده راحت فراهم می کند.
ذخیره سازی: کربن و منبع انرژی
استفاده از گلوکز به عنوان محیط کشت برای رشد انتروباکتریها به حدی گسترده است که با وجود چندین ویژگی غیرمعمول متابولیسم آن توسط تخمیر هوازی به عنوان یک کربن استاندارد و منبع انرژی انتخاب شد و محیط MOPS تا حد زیادی با آن توسعه یافت. ما دو غلظت مشخص کردیم. بالاتر از لحاظ تئوری قادر به حمایت از رشد به تراکم سلولی ۱٫۵ میلی گرم (وزن خشک) در میلی لیتر است که پنج برابر بالاتر از حداکثر است (Al20 = 2.0 ؛ ۰٫۲۸۶ میلی گرم [وزن خشک] / میلی لیتر) که برای مطالعات فیزیولوژیکی توصیه می شود. این سطح برای سرعت رشد اشباع است. سطح پایین تر برای تهیه محیط کشت های یک شبه انتخاب شد. از رشد نمایی تا تراکم نوری ۱٫۰۵ (وزن ۱۵/۰ میلی گرم از سلول / میلی لیتر) پشتیبانی می کند. قبل از شروع اندازه گیری سلولهای حاصل از این كشتهای گلوكلوسلوموله تلقیح مناسب برای بیشتر آزمایشات است ، تا زمانی كه دوره رشد مناسب مجاز باشد (ترجیحاً سه نسل). از طرف دیگر در بسیاری از موارد ترجیح می شود محیط کشت های سبکی با سلولهایی که در حال حاضر در معرض رشد قرار دارند تلقیح شود. اندازه تلقیح را می توان به گونه ای تنظیم کرد که در یک زمان مشخص در روز بعد کشت در تراکم مورد نظر قرار گیرد.

مواد مغذی در کشت انتروباکتری ها
مواد مغذی فسفات و سولفات در محیط کشت جدید تنظیم شد مانند گلوکز در مقادیر معادل یک محصول سلولی ۱٫۵۰ میلی گرم (وزن خشک) در میلی لیتر (A520 = 10.5) که از مطالعات تغذیه ای با S. typhimurium NT1 محاسبه شده است. برای همه اهداف عملی این غلظتها با توجه به نرخ رشد اشباع می شوند. همچنین سطح سولفات برای سرکوب تخریب MOPS توسط E. coli کافی است. سطح منیزیم موجود در محیط کشت باید در غلظت سه برابر بالاتر تنظیم می شد زیرا به اندازه کافی مشخص نبود که سطح معادل یک محصول سلولی ۱٫۵۰ میلی گرم در میلی لیتر از لحاظ سرعت رشد اشباع می شود. اگرچه برای S. typhimurium مشخص شده است. ممکن است سطح این مؤلفه ها برای کلیه اهداف عملی برای E. coli متعادل باشد. نمکهای خاص مورد استفاده (K2HPO ، K2SO ، و MgCl2) به دلیل در دسترس بودن انتخاب آنها از پتاسیم یا کلرید به عنوان یک پیشخوان و خصوصیات نسبتاً مطلوب این محیط کشت ها با توجه به پایداری، حلالیت، ظرافت و حضور آلاینده ها انتخاب شدند.

نسبت غلظت عناصر در محیط

همان ویژگی ها برای منبع نیتروژن در محیط کشت انتروباکتری انتخاب شده NH4Cl وجود دارد. حالت دوم عمداً در سطح معادل معادل سلولی ۱٫۰ میلی گرم در میلی لیتر (A420 = 7.0) تنظیم شده است به گونه ای که در صورت وجود بستر کربن اضافی کشتهای موجود در این محیط همه در همان تراکم یکسان و با فاز ثابت قرار می گیرند. همان محدودیت نیاز به آهن اضافه شده به راحتی با محیط کشت هایی مانند استات نشان داده می شود که بطور عمده توسط مسیرهای اکسیداتیو با استفاده از پروتئین های آهن متابولیزه می شوند و با استفاده از گلیسرول یا گلوکز به آسانی کمتر می شوند. با وجود بعضی از رسانه ها که حاوی غلظت بالایی از نمک های فسفات هستند (به عنوان مثال دیویس-مینگولی ، M9 و وکرمن) یک نیاز آهن کمتر به راحتی نشان داده می شود. احتمالاً به دلیل معرفی آهن به عنوان یک آلاینده پرماجرا. ما سطح آهن را در محیط MOPS در ۱۰ ثانیه در میلی متر برای محیط کشت تنظیم می کنیم زیرا برای منابع کربنی که معمولاً مانند گلوکز و گلیسرول استفاده می شود کاملا اشباع است اما هنوز قابل تشخیص نیست. برای رشد روی استات (و احتمالاً ساکینات) مقدار آهن باید پنج برابر افزایش یابد. در این سطح آهن اشباع با سرعت رشد خواهد بود و محیط فقط رنگ زرد مایل به زرد خواهد داشت (A420 = 0.012). یک دوره جایگزین برای افزایش مقدار کلات کلریدنی Tricine-isnot به دلیل محدوده بهینه غیرمترقبه غلظت آهن تحت این شرایط توصیه می شود. ما دریافته ایم که هپاتیدرات FeSO4 یک نمک مناسب برای کنترل است. مقدار کمی سولفاتدر محیط کشت باکتری ها (کمتر از ۴٪) که به سولفات عرضه شده به عنوان K2SO4 اضافه می کند تنها یک نقض جزئی از اصل ما در استفاده از منابع واحد از مواد مغذی اصلی است. در صورت نیاز به شرایط خاص FeCl2 را می توان به راحتی جایگزین کرد.
ریز مغذی ها
در صورت عدم وجود روشهای حساس برای تعیین نیازهای کمی از انتروباکتریها در محیط کشت برای مس، منگنز، کبالت، مولیبدن، بور و روی لازم است استراتژی متفاوتی اتخاذ شود. اجزای یک محلول ریز مغذی (ماکلیس) که برای حمایت از رشد قارچ ها تولید شده بود هرکدام از نظر سمیت به سوی گونه های انتروباکتریها مورد آزمایش قرار گرفتند. اثرات مهاری فقط در غلظت ۱۰۰۰ برابر بالاتر از محلول ماچلیس مشاهده شد. با استفاده از ایمنی می توان یک غلظت ۱۰۰ برابر کمتر برای محیط MOPS را مشخص کرد تا اطمینان حاصل شود که سلولهای باکتریایی برای این عناصر اشباع می شوند و نوسانات آزمایشگاهی به آزمایشگاه در سطح آلودگی سایر اجزای محیط (از جمله ظروف شیشه ای و آب) ناچیز خواهد بود. همانطور که گفته شد. کشف بعدی جهش یافته ای که به مکمل ریز مغذی محیط MOPS پاسخ می دهد نیاز به چنین عناصر را تأیید می کند و شمول عمدی آنها را توجیه می کند.
غلظت نمک

تلاش برای بالاترین سرعت رشد و کم ترین غلظت محیط کشت

گنجاندن ۵۰ میلی مولار سدیم کلسیم در فرمول نهایی محیط کشت مورد نظر با بی میلی انجام شد. تلاش شده است که غلظت هر یک از اجزای محیط را در پایین ترین سطح سازگار با سرعت رشد مطلوب و یک محصول نظری سلول ۱٫۵۰ میلی گرم (وزن خشک) در میلی لیتر قرار داده شود. این محافظه کاری مبتنی بر تمایل به حداقل رساندن فرصت برای معرفی پرماجرا مواد تحریک کننده یا مهاری بود. هیچ نیاز شناخته شده ای از باکتری ها برای سدیم وجود ندارد و مقدار کلرید موجود در محیط موجود در مقدار کافی به نظر می رسد. هیچ نشانه ای نمی توان یافت که تحریک جزئی اما واقعی رشد با ۵۰ میلی مولار سدیم کلسیم حاصل از آلاینده ها بود. به طور آزمایشی نتیجه می گیریم که به سادگی به استحکام یونی محیط کشت کمک می کند. در صورت تمایل به استفاده از یک محیط کاملاً عاری از سدیم ، بدون شک KCl می تواند برای NaCl که به طور خودسرانه انتخاب کردیم جایگزین شود.

رشد هوازی در محیط کشت باکتری ها (گازهای محلول)

این محیط کشت با استفاده از رشد هوازی به عنوان یک راهنمای تعیین کننده تولید شده است. البته این از رشد بی هوازی پشتیبانی می کند ، اما ما تحت این شرایط هیچ اندازه گیری گسترده ای در خصوص ویژگی های آن انجام ندادیم. فلاسکهای ارلنمایر در حال چرخش که مورد استفاده قرار می گرفتیم هوادهی مناسبی را ارائه می دهند. اما دشواری پاسخگویی به نیاز اکسیژن از محیط کشت های باکتریایی با سرعت زیاد و در حال رشد کاملاً آشکار است. به همین دلیل ما در مطالعات فیزیولوژیک حد بالایی چگالی سلول را با این ماده به عنوان A420 2.0 (دقیقاً کمتر از ۰٫۳ میلی گرم از وزن خشک در میلی لیتر) تعریف کرده ایم. ما به دلیل ناراحتی آن مشکل در استانداردسازی ترکیب گاز از آزمایشگاه به آزمایشگاه احتمال معرفی آلاینده های شیمیایی به عنوان آلاینده های ناشی از گاز و مشکلات ناشی از CO2 استفاده از هوادهی اجباری (پاشش) را در نظر گرفته و رد کردیم. نیاز سلولهایی که در گلوکز در حد متوسط رشد می کنند.

کشت باکتری ایی کولای

به نظر می رسد موضوع اخیر در قلب رفتار E. coli بر رقت زیاد در محیط کشت گلوکز-MOPS قرار داشته باشد. مدت زمان تاخیر چند ساعته در این شرایط برای کلیه اهداف عملی با شامل ۱۰ میلی متر NaHCO در محیط حذف می شود. این نتیجه مطابق با گزارش های قبلی در مورد نیاز CO2 به E. coli است که از نظر هوازی در محیط گلوکز حداقل رشد می کند. مشکل با S. typhimurium NT1 حاد کمتر است و از جمله NaHCO.3 غیر ضروری به نظر می رسد. لازم به ذکر است که برای تهیه محیط کشت مناسب حداقل دو دلیل عملی وجود دارد که بخواهیم بتوانیم بدون معرفی دوره تاخیر چند سلول در میلی لیتر را رقیق کنیم. اول این تکنیک در صورت وجود دستگاه رقت اتوماتیک مداوم برای حفظ سلول ها در رشد متعادل برای دوره های طولانی مفید است و دوم پیش بینی عالی رشد سلولی باعث می شود که یک روز از قبل فرهنگ ها آماده شود و دارای نمایی باشد. سلول های فاز در یک تراکم خاص آماده در یک زمان از پیش تعیین شده روز بعد.

محیط کشت جدید باکتری

راحت ترین ویژگی محیط کشت جدید این است که می توان آن را به عنوان یک کنسانتره ۱۰ برابری تهیه کرد که در محل رقیق سازی فقط نمک فسفات و یک منبع کربن وجود دارد. برای بسیاری از محققان ، کمترین ویژگی مناسب رسانه ممکن است ضرورت افزودن مواد مغذی و ضرورت عقیم سازی فیلتر باشد. استریل کردن هر محیط کشت به وسیله اتوکلاو به دلیل دشواری در دستیابی به محصول قابل تولید مجدد توصیه نمی شود. اتوکلاو کردن این محیط خاص به دلیل عدم مقاومت گرمای بافر امکان پذیر نیست. عقیم سازی فیلتر. با این حال به راحتی با در دسترس بودن فیلترهای غشایی از پیش تعیین شده (و نگهدارنده) انجام می شود که این نیاز یک مورد تحمل محسوب نمی شود. فقط محیط غلیظ نیاز به استریل فیلتر دارد. آب مقطر اتوکلاو شده به طور معمول برای تهیه محیط مورد استفاده قرار می گیرد. مراقبت های لازم برای تهیه این محیط با توجه به اهمیت این جنبه از مطالعات فیزیولوژیکی بسیار ناچیز است.

مزایای استفاده از محیط مایع در کشت بافت

استفاده از محیط کشت مایع برای تکثیر انبوه در شرایط آزمایشگاهی اغلب به عنوان روشی برای کاهش هزینه گیاهان آزمایشگاهی توصیف می شود. مزایای آن شامل زمان تکثیر کمتر برای کاشت است زیرا نیازی به استقرار در محیط ندارند بلکه به سادگی با آن در تماس هستند. ترکیب محیط کشت را می توان با انتقال ساده تغییر داد. استریل سازی محیط می تواند با استفاده از اولترافیلتراسیون انجام شود نه اتوکلاو. تسلط بر کشت آزمایشگاهی در محیط مایع یک گام ضروری برای دستیابی به اتوماسیون روش های مختلف تولید انبوه است.
مزایای استفاده از محیط کشت های مایع برای تقویت انتشار شاخه ها، رشدیا جنین زایی سوماتیک برای چندین گونه گزارش شده است. مکانیسم های درگیر در این عملکرد بهبود یافته با دقت مشخص نیست. عدم وجود ماده ژل ممکن است در دسترس بودن آب و مواد محلول در محل موردنظر را بالا ببرد.

مشکلات استفاده از محیط کشت مایع
با این حال استفاده از محیط کشت های مایع شامل مشکل آسفکسی از گیاهچه ها در نتیجه غوطه وری است. متداول ترین روش های پیشگیری بر اساس اصل غوطه وری جزئی از اکتشافات برای اطمینان از هوادهی است. از مواد جاذب بی اثر برای حفظ تماس بین محیط و قسمت زیرین پیوند (کاغذ فیلتر، سلولز، سنگ پشم و غیره) استفاده می شود و یا از عمق متوسط برای فعال شدن ظهور جزئی از بافت کاوش استفاده می شود. اکسیژن رسانی مستقیم محیط کشت توسط حباب نیز می تواند در تولید انبوه مورد استفاده قرار گیرد. این روش های کشت متوسط مایعات روی گونه های مختلف آزمایش شده اند و به طور مستقیم مقایسه نشده اند.

در رابطه با کشت قارچ های بیماریزای پوست و نوع محیط کشت اگرچه یک روش استاندارد برای تست حساسیت پوستی وجود ندارد گزارش های متعددی وجود دارد که آزمایش حساسیت ضد میکروبی درماتوفیت ها را با استفاده از ماکروودایلوژ آگار یا ماکروودایلوشن آگار و تست های میکرودایلوشن و میکرودایلوشن انجام داده است. این گزارش ها به طور کلی ادامه روش های M27-A2 یا M38-A روی محیط کشت بوده اند. نتایج به دست آمده توسط برخی نویسندگان تنوع بسیار خوبی را نشان داده اند احتمالاً به دلیل عدم استاندارد سازی پارامترهای مختلفی که می توانند در تعیین MIC تأثیر بگذارند مانند روش تهیه تلقیح تلقیح و طول و دمای انکوباسیون. در یک مطالعه چند متری سطح بالایی از توافق داخل و کارگر برای تعیین MIC های انجام شده در محیط کشت RPMI در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد و با استفاده از یک دوره کشت ۴ روزه انجام شده است. برای آزمایش قارچ های رشته ای با برخی از سازگاری ها اول از همه از فیلترهای واتمن مدل ۴۰ برای جدا کردن قارچ از کنیدی استفاده می شود در نتیجه تلقیح همگن شامل تنها میکروکنیدی ها است. جداسازی این ساختارها یک گام مهم در تعیین MIC است زیرا احتمالاً حساسیت های ضد قارچی هیفا و میکروکنیدی ها متفاوت هستند.

دمای ایده آل
دمای ایده آل قرار دادن محیط کشت حاوی قارچ یعنی ۲۸ یا ۳۵ درجه سانتیگراد هنوز هم مورد بحث است. به خوبی شناخته شده است که اکثر گونه های درماتوفیت هنگامی که دمای کشت بین ۲۸ تا ۳۰ درجه سانتیگراد باشد رشد بهینه را نشان می دهد . با این حال درجه حرارت بالاتر مانند ۳۵ یا ۳۷ درجه سانتیگراد نیز پیشنهاد شده است. این پارامتر تأثیر معنی داری بر MIC برای مدت زمان کشت خاص در کلیه محیط کشت های آزمایش شده نشان نداده است.

مدت زمان کشت
تعدادی از نویسندگان برای آزمایش درماتوفیت ها روی محیط کشت قارچ پوستی زمان های مختلف کشت از ۳ تا ۲۰ روز را پیشنهاد داده اند. پس از ۴ روز T. rubrum رشد ضعیفی مشاهده شد. با این حال ۷ روز مشاهده شد که برای مشاهده قابل توجه رشد چاههای کنترل کافی است. طبق مطالعه دیگری ۴ روز کشت را برای مشاهده رشد چشمگیر در چاه های کنترل کافی است. تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که افزایش زمان کشت روی محیط کشت نه تنها ۱۰ روز در مقایسه با ۷ روز باعث افزایش MIC های ۱ تا ۲ رقت با همان محیط بلکه ۷ روز نسبت به ۴ روز می شود. استثناء در مورد تربینافین وجود دارد جایی که زمان کشت بر MICs تأثیر نمی گذارد.

مقایسه محیط کشت های مختلف
همه محیط کشت های آزمایش شده (براث استاندارد RPMI ، MVM و SDB) نتایج آماری متفاوتی ارائه دادند (۰۵ / ۰P) بدون فاصله رقت به جز تربینیناف. MIC بزرگتر با RPMI بافر نسبت به سایر محیط های آزمایش شده بدست آمد. محیط پیشنهادی NCCLS رشد كافی همه ایزوله ها را تأیید می كند و تأیید می كند كه این محیط رشد قابل مشاهده مناسب قارچ های رشته ای از جمله درماتوفیت ها را ایجاد می كند. بین MVM و SDB ، اولین محیط کشت ی بود که در مقایسه با RPMI بیشتر شبیه بود. اگرچه MVM یک وسیله شیمیایی تعریف شده است که اغلب در تعیین MIC برای پاراکوکسییدوئید brasiliensis به روش macrodilution براث مورد استفاده قرار می گیرد، خواندن MIC در صفحات میکرودایلوشن سخت تر است زیرا شفافیت این محیط کشت در مقایسه با رنگ زرد رسانه های دیگر که در هنگام تجسم اشتباه گرفته می شود. گزارشی در مورد استفاده از محیط MVM در تعیین MIC برای قارچهای پوستی گزارش نشده است.
گزارش های کمی در مورد استفاده از محیط SDB برای تعیین MIC برای هر گونه قارچ از جمله درماتوفیت ها وجود دارد. ما SDB را آزمایش کردیم زیرا هزینه آن به میزان قابل توجهی پایین تر از سایر محیط های آزمایش شده ذکر شده در بالا است و در کلیه آزمایشگاه های قارچ شناسی استفاده می شود. با این حال محیط کشت SDB MIC پایین تر را نشان داد و در مقایسه با MVM و RPMI اختلاف معنی داری داشت (۰۵/۰ P).

روش مناسب برای کشت درماتوفیت ها
ارزیابی فعالیتهای آزمایشگاهی داروهای آزمایش شده روی محیط کشت نشان داد که تربینینین قوی ترین داروی فعال است. در نتیجه روش میکرودایلوشن برای درماتوفیتها مناسب و قابل تکرار است. نگهداری ایزوله ها در نمک استریل قبل از انتقال به سیب زمینی دکستروز آگار باعث افزایش تولید کنیدی می شود و استفاده از تلقیح حاوی تنها این ساختار را امکان پذیر می کند. به نظر می رسد که محیط کشت استاندارد RPMI یک وسیله آزمایش مناسب برای تعیین MICs برای تریکوفیتون روبروم است و داده های نویسندگان را که RPMI را برای آزمایش درماتوفیت ها توصیه می کنند تقویت می کند. در واقع دما به طور مداوم بر MIC اثر نمی گذارد و نشان می دهد که آزمایش ها می توانند در دمای ۲۸ یا ۳۵ درجه سانتیگراد انجام شوند. با این حال MIC های به دست آمده در زمان های مختلف نگهداری در محیط کشت باید با نتیجه بالینی در ارتباط باشند تا نشان دهند کدام زمان قابلیت اطمینان بهتری دارد.

کاربرد آنتی بیوتیک سیکلوهگزمید در محیط کشت

مشخص شده است که وجود سیکلوهگزیمید در محیط کشت در افزایش تعداد ایزوله های قارچ های بیماری زا از مواد بالینی و سایر منابع دارای ارزش تاثیر گذار است. بسیاری از محیط های درماتوفیت را از موارد مشکوک به انیکومایکوزیس در انسان جدا سازی شده است و از مقیاس گاو و موهای زائد حیوان مشکوک به استفاده از یک محیط سیکلو هگزیمیدکن حاوی سیکلو هگزیمیدکن حاوی محیط های مشابه که حاوی سیکلوهگزیمید نیستند. طبق مطالعات انجام شده مشخص شد که كه استفاده از محیط کشت های سیكلوهگزیمیدكنترل در مایكوزهای انسانی فقط تعداد کمی بیشتر از ایزول ها را نسبت به آگار ناخوشایند مجاز می داند اما تعداد قارچ های ساپروفیت در لوله ها کاهش یافته است.. در این مطالعات نسبتاً معدود بیمار مورد بررسی قرار گرفتند. محیط سیکلوهگزیمید در کشت مواد کلینیکی دارای آلودگی توسط کپک های ساپروفیتیک است اما در محیط Littman در ظرف پتری رشد درماتوفیت ها زودتر آغاز شده است.

موارد استفاده محیط کشت دارای سیکلوهگزمید

از محیط کشت آنتی بیوتیک دار سیکلوهگزیمید در جداسازی Coccidioides immitis و در جداسازی درماتوفیت ها از کفش و غرفه دوش استفاده شده است. روزنتال دانشمندی بود که موفق شدند درصد بیشتری از ایزوله ها را از رسوبات آب حمام پا با استفاده از یك محیط حاوی سیكلو هگزیمید مشابه نسبت به سایر رسانه ها بدست آورند. از قارچ های بیماری زا مورد مطالعه انسان به نظر می رسد Cryptococcus neoformans ، Allescheria boydii و Aspergillus fumigatus تنها گونه هایی هستند که توسط سیکلوهگزیمید در غلظت های معمول در محیط کشت قارچ شناسی مهار می شوند.

مقایسه محیط دارای سیکلوهگزمید با محیط کشت خالص

استفاده از محیط کشت آگار سیکلوهگزیمید-چیورامفنیکلول در ۷۱۹ بوته از ۶۰۰ بیمار پوست پیوسته نشان داده است که این برتری نسبت به آگار استاندارد Sabouraud به عنوان یک محیط جداسازی برای کشت روتین پوستی است. با استفاده از این محیط لوله های آلوده بیش از ۵۰٪ کاهش یافته و جداسازی درماتوفیت ها تقریباً ۱۰۰٪ افزایش یافته است. ناخالص و ۳۷۰ جوامع DEEMATOLOGY INVESTIGATIVE میکروسکوپی درماتوفیت با درج این آنتی بیوتیک ها در غلظت مورد استفاده تغییر نمی کند. اگرچه چند قارچ از اهمیت پاتولوژیک توسط سیکلوهگزیمید مهار می شود اما بروز این گونه ها در منطقه نیویورک نادر است. برتری اثبات شده از محیط کشت آنتی بیوتیک دار غنی شده در جداسازی درماتوفیتها ما را در واحد پوست و سرطان نیویورک ترغیب کرده است که از سیکلوهگزیمید – کلرامفنیکلول حاوی آگار به عنوان واسطه استاندارد جداسازی در تشخیص قارچ شناسی استفاده کنیم و جایگزین محیط Sabouraud شود.

نقش آنتی بیوتیک ها در سرکوبی ساپروفیت ها

نقش دقیق این آنتی بیوتیک ها در محیط کشت ها در جداسازی پایه پوستی کاملاً مشخص نشده است. تا حد زیادی به دلیل سرکوب ارگانیسم های ساپروفیت به سرعت در حال رشد است اما به نظر می رسد عوامل دیگر درگیر هستند. این ایده با این واقعیت پشتیبانی می شود که در ۲۶ مورد گزارش شده در اینجا محیط Sabouraud کاملاً استریل باقی مانده است در حالی که درماتوفیت ها روی لوله های سیکلوهگزیمید مربوطه ظاهر می شوند. بر اساس یک نظریه آنتی بیوتیك ها با عملكرد بر روی سیستم های آنزیمی تغییر قارچ ها از انگلی به مرحله ساپروفیت را تسهیل می كنند. تحقیقات بیشتر در این زمینه شاید بسیار سودمند باشد.

خلاصه مطلب

در معاینه معمول قارچ شناسی ۶۰۰ بیمار پیاپی، سیکلوهگزیمید- کلرامفنیکلول محیط کشت آگار در جداسازی درماتوفیتها نسبت به آگار سابورود بسیار برتر است. تقریباً دو برابر بیشتر از محیط حاوی آنتی بیوتیک نسبت به محیط صبورود جدا شد. به نظر می رسد محیط سیکلوهگزیمید-کلرامفنیکل به ویژه در کشت مواد از پوست سر، پا، ناخن و ناخن مفید است. در موسسه ما محیط حاوی سیکلوهگزیمید-کلرامفنیکلول جایگزین آگار استاندارد Sabouraud به عنوان محیط کشت انتخابی در قارچ شناسی تشخیصی معمول شده است.

مطالعه روی قارچ های پوسیدگی سفید

ارقام قارچ پوسیدگی سفید Phanerochaete chrysosporium و Pleurotus ostreatus (IE8) با رشد روی محیط کشت قارچ پیچیده آگار حاوی یکی از ۲۳ رنگ صنعتی مورد آزمایش نشان داد که P. ostreatus قادر به تجزیه ۱۲ از ۲۳ رنگ صنعتی در در ریسه خود بود در حالی که P. chrysosporium فقط ۵ رنگ را تجزیه کرد. این رنگهای صنعتی بر اساس پایداری آنها به طیف وسیعی از pH (pH 3–۱۱)، دما و مقاومت در برابر شرایط در میحط کشت در فلاسکهای مجزا انتخاب شدند. این ظرفیت تجزیه رنگ محیط کشت قارچ های تجزیه کننده با آنزیم های خارج سلولی همراه بود. با این حال عصاره خارج سلولی خام از P. ostreatus قادر به تجزیه تنها پنج رنگ بود که نشان می دهد که سایر مکانیسم های آنزیمی می توانند در تجزیه رنگ در آزمایشات داخل بدن نقش داشته باشند. عصاره خام خارج سلول از Trametes hispida که بر روی دانه جو دوسر رشد کرده است قادر به تجزیه رنگ محیط کشت رنگدانه دار در شرایط آزمایشگاهی ۱۱ از ۲۳ رنگ صنعتی بود.

آنزیم های تولید شده توسط قارچ های پوسیدگی سفید

با هدف یافتن فعالیت تجزیه رنگی بیشتر در محیط کشت و به دلیل آنزیم های لیگنینولیتیک خارج سلولی نشان داده شده است که با رشد در لایه های طبیعی لیگنین تحریک می شوند. Pleurotus ostreatus که به عنوان یک سویه شاخص از آزمایش های اولیه استفاده می شود در محیط های حاوی بسترهای مختلف لیگنین سلولز تولید شد. كشت جامدات با گندم كامل و جو در محیط کشت مایع در محيط كشت جامد مقايسه شد. این بسترهای طبیعی باعث تولید آنزیم های لیگنینولیتیک لاکاز و پراکسیداز منگنز شده و عصاره خارج سلولی خام ظرفیت تجزیه رنگ بالاتر رنگ نسبت به دست آمده از محیط پیچیده را نشان می دهد. P. ostreatus رشد یافته در جو دوسر بالاترین میزان تولید آنزیم حجمی و اختصاصی و فعالیت های رنگ آمیزی را نشان داد. میزان تولید فعالیت لاکاز در کشت جو دوسر ۷٫۵ برابر بیشتر از کشت مایع بود و فعالیت رنگ زدایی در برابرReactive blue از عصاره جو دوسر فاز جامد ۲۳ برابر بیشتر از ماده رویی محیط کشت متوسط پیچیده بود. هیچ فعالیت لیگنین پراکسیداز یا آریل الکل اکسیداز در هیچ یک از مایع رویی کشت P. ostreatus IE-8 مشاهده نشد.

مطالعه روی عصاره سلولی قارچ ها در تجزیه رنگدانه محیط کشت

پس از این تمام قارچها در تخمیر حالت محیط کشت جامد روی جو دوسر رشد کردند. عصاره های خارج سلولی برای تولید آنزیم و رنگ آمیزی مورد آزمایش قرار گرفتند. فعالیت های لیگنین پراکسیداز، منگنز پراکسیداز، لاکاز و الکل ویتریل الکل اکسیداز در عصاره های خام از ۱۶ گونه قارچی مشخص شد. تمام گونه های P. ostreatus در تجزیه ۵ رنگ آزمایش شده محیط کشت رنگدانه در سطوح مختلف فعال بودند اما T. hispida بالاترین فعالیت حجمی را نشان داد. سویه های Bjerkandera adusta پراکسیداز منگنز بالا اما فعالیت کم رنگ و لاکاز را کاهش دادند و Phryerochaete chrysosporium که به عنوان تولید کننده آنزیم های لیگنینولیتیک تحت رشد نیتروژن کم شناخته شده است هیچکدام از آنزیم ها را تولید نکرد و رنگها را در این شرایط رشد تجزیه نکردند. از چهار فعالیت آنزیمی مورد سنجش در این عصاره ها تنها به نظر می رسد که لاکاز با رنگ زدایی رنگ با همبستگی رنگ ارتباط دارد و Trametes hispida بالاترین تولید فعالیت لاکاز را نشان داد که مطابق با بالاترین فعالیت تجزیه رنگ است. هیچ فعالیت لیگنین پراکسیداز را نمی توان در هر یک از گونه های قارچ کشت شده در شرایط رشد روی محیط کشت قارچ های تجزیه کننده رنگدانه تشخیص داد.