دسته: محیط کشت ها

اووا از همستر طلایی به راحتی در شرایط آزمایشگاهی در محیط کشت قابل لقاح است. از زمان این کشف گامتهای همستر توسط محققان بی شماری برای بررسی جزئیات لقاح و وقایع مرتبط با آن (ظرفیت اسپرم و واکنش آکروزوم) در شرایط آزمایشگاهی استفاده شده است. از چندین جنبه مهم سیستم لقاح همستر در شرایط ازمایشگاهی یکی از مدلهای مفیدی است که ما برای مطالعه تعامل گیمت پستانداران داریم.

بررسی موفقیت جنین دو سلولی
با استفاده از یک محیط کشت جنین مبتنی بر محلول Tyrode استفاده شده است. شواهد مورفولوژیکی باروری تقریباً ۹۰٪ تخمک های همستر تلقیح آزمایشگاهی را نشان می دهد. حداکثر ۹۰٪ تخمکهای لقاح آزمایشگاهی می توانند یک بار در کشت تقسیم شوند تا ۲ درجه تولید کنند. جنین هایی که با بررسی میکروسکوپی نوری از نظر مورفولوژیکی طبیعی به نظر می رسند. هیچ شکاف دیگری از چنین جنین ها رخ نمی دهد، از این رو ظرفیت توسعه تخمک های همستر لقاح آزمایشگاهی در محیط کشت جنین همستر را نمی توان مشخص کرد. جنینهای ۲ سلولی همستر که از زنان جفت شده بهبود می یابند نیز در شرایط آزمایشگاهی نتوانند از بین بروند. هیچ گزارشی در مورد موفقیت آمیز بودن سلول ۲ سلول همستر منتشر نشده است. یا جنین ۴ سلولی. اگر این “بلوک ۲ سلولی” از بین برود سودمندی همستر در سیستم لقاح آزمایشگاهی به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. علاوه بر این توانایی به دست آوردن توسعه کامل قبل از پیوند (زایگوت به بلاستوسیست) جنین همستر در شرایط آزمایشگاهی می تواند علاوه بر ارزشمندی از مدلهای حاضر برای مطالعه رویان شناسی اولیه پستانداران باشد.

بررسی موفقیت جنین های ۸ سلولی
جنینهای ۸ سلولی همستر کشت شده روی محیط کشت که از زنان جفت شده بهبود یافته اند ، در محلول اصلاح شده Tyrode به مرحله بلاستوسیت کشت داده می شوند ، و پیشرفت بسیار کمتری در رسانه های معمولی Kreb’s-Ringer-bicarbonate معمولی که برای جنین موش استفاده می شود انجام می شود. تعداد بسیار کمی از جنین همستر کشت شده پس از انتقال به گیرندگان ایجاد شده است. ماهیت این تفاوت مشخص نیست. شناسایی اجزای خاص محیط کشت که برای تداوم رشد جنین های همستر مهم هستند ، ممکن است اطلاعات قابل استفاده در مورد جنین سایر گونه های پستانداران را فراهم آورد ، که اغلب در مراحل موفقیت آمیز کشت از مراحل اولیه شکاف دشوار است.

کشف مدل جدید برای بررسی اولیه پستانداران

در این مطالعه جنین همستر ۸ سلولی به یک مرحله بلاستوسیست در یک محیط کشت رشد یافته برای لقاح همستر تخم مرغ رسیده است. بعضي از جنين هاي كشت شده تا مرحله بلاستوسيست كشت داده شده بودند. همانطور كه ​​توسط زايمان هاي جوان طبيعي پس از انتقال جنين نشان داده شده است. این نتایج بخشی از برنامه با هدف دستیابی به توسعه کامل قبل از پیوند جنین های همستر در شرایط آزمایشگاهی از مرحله زایگوت تا بلاستوسیست (B4) است. تکمیل این برنامه می تواند یک مدل جدید با ارزش برای بررسی رشد اولیه پستانداران فراهم کند. در اکثر آزمایش های توصیف شده در مطالعه حاضر جنین های داخل محیط کشت از همسترهای زنانه تخلیه شده به دلایل بارز اقتصادی و طراحی آزمایشگاهی بدست آمده است. اگرچه می توان ادعا كرد كه نیاز محیط برای جنین به دست آمده از این طریق می تواند متفاوت از جنین های بدست آمده از تخمك گذاری طبیعی باشد اما دلیلی بر این باور نیست كه شاید این مورد باشد. سایر محققان نشان داده اند كه تخمدان همستر فوق تخمك زده شده در داخل بدن بارور می شود و در داخل بدن از رشد عادی استفاده می شود. ویژگیهای جنین همستر را رشد موفقیت آمیز در مرحله مرحله ۸ سلولی را محدود می کند و بنابراین ممکن است برای مراحل اولیه توسعه نیز مهم باشد.

جنین های ۸ سلولی اولیه و نهایی
بارزترین ویژگی توانایی رشد افتراقی در محیط کشت جنین توسط جنین های ۸ سلولی زودرس و اواخر است. تنها ۲٪ از جنین های اولیه ۸ سلولی قادر به ایجاد بلاستوسیست در محیط غیراصولی (TALP) بودند.در حالی که ۲۲٪ اواخر ۸ سلولی بود. جنین از این نتایج استنباط می شود که تغییر مهمی در توانایی های متابولیکی جنین های پیش از بغل موش بزرگ در مرحله ۸ سلولی اتفاق می افتد. این تغییر در برخی از جنین بین ۵۴ ساعت و ۶۲ ساعت پس از فعال شدن تخم رخ می دهد. کشف ماهیت این تغییر می تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد علت بلوک توسعه مشاهده شده در مراحل جنینی قبلی در محیط کشت همستر ارائه دهد. نتایج ما همچنین نشان می دهد که پیشرفت جنین های اولیه ۸- سلول به شدت وابسته به حضور اسیدهای آمینه در محیط است. نسبت درصد جنین ها در حضور و در صورت عدم وجود اسیدهای آمینه در حال رشد ۱۸: ۱ بود.

نقش اسید آمینه در رشد جنین کشت شده

اسیدهای آمینه رشد مراحل اولیه و اواخر ۸ سلولی را به همان میزان افزایش داده است. در حضور اسیدهای آمینه در محیط کشت جنین همستر ۳۴٪ اضافی از جنینهای اولیه ۸ سلولی در مقایسه با پاسخ در محیط غیرمستقیم به بلاستوسیستها تبدیل می شوند ، و ۴۴٪ دیگر از جنین های اواخر ۸ سلولی تحت شرایط مربوطه.این مقادیر بسیار مشابه هستند. بنابراین هیچ تفاوت واقعی در پاسخهای مشاهده شده به اسیدهای آمینه از ۲ گروه جنین وجود ندارد. با توجه به تظاهرات ما از یک نیاز تا جنین ۸ سلولی اولیه به نظر می رسد که جنین برای همان اسیدهای آمینه داخل محیط کشت برای بلوغ تخمک همستر ضروری است. به نظر می رسد که مراحل متوسط ​​رشد (۱ سلولی از طریق جنین ۴ سی دی) نیز این نیاز را نشان می دهد. وابستگی به این اسیدهای آمینه ممکن است یکی از عوامل مؤثر در بلوک ۲ سلولی در رشد در شرایط آزمایشگاهی باشد. اما عوامل یا شرایط دیگر باید دخیل باشد زیرا تعداد کمی از جنین های ۴ سلولی (۴٪) که در بلاستوسیست ها در اسید آمینه تکمیل شده اند باید درگیر شوند. محیط کشت و جنینهای ۲ سلولی به هیچ وجه در این محیط شکاف ندارند. تلاش های ما برای افزایش نسبت جنین های اولیه ۸ سلولی در حال توسعه به بلاستوسیست ها با اضافه کردن مکمل ویتامین MEM Eagle به و با تغییر pH یا فشار اسمزی محیط ناموفق بودند. جنین ۸ سلولی همستر به نظر می رسد قابل تحمل به تغییرات در pH و اسمولاریته است.

مقایسه رشد جنین موش و جنین همستر در محیط کشت ها

مشاهدات فوق روی محیط کشت از چندین جنبه متفاوت از مواردی است که توسط چندین محقق گزارش شده با استفاده از جنین قبل از پیدایش اندام ها از موش که به طور گسترده به عنوان مدل برای مطالعه توسعه اولیه استفاده می شود متفاوت است. تأثیر واضح فشار اسمزی بر رشد جنین های موش در فرهنگ نشان داده شده است. با دامنه بهینه کاملاً تعریف شده. اثر برجسته pH بر رشد جنین موش توسط برینستر نشان داده شد. در محدوده بهینه برای این متغیرها جنین های موش به آسانی به مرحله بلاستوسیست در محیط کشت های شیمیایی تعریف شده ساده و حاوی BSA و منابع انرژی مناسب می رسند. یا حتی در یک رسانه متوسط ​​فاقد آمینو اسیدها و BSA. بنابراین جنین موش نسبت به ترکیبات شیمیایی محیط آن بسیار تحمل می شود. از این نظر موش ممکن است الگویی ایده آل برای ارائه اطلاعات مربوط به توسعه قبل از پیدایش اندام ها قابل استفاده برای پستانداران به طور کلی باشد. جنین های اکثر گونه های پستانداران مورد مطالعه قرار گرفته اند از جمله همستر (مطالعه حاضر)، سایر حیوانات آزمایشگاهی و گونه های حیوانات اهلی برای رشد در محیط کشت بسیار دشوارتر به نظر می رسند. در اکثر گزارش های منتشر شده ، فقط با رشد بسیار کمی جنین های اولیه این گونه ها با استفاده از انواع محیط های کشت به نظر می رسد که برای رشد جنین های موش مناسب هستند.

مطالعات فیزیولوژی فیتوپلانکتون های دریایی با توانایی ما در پرورش آنها در رسانه های مصنوعی بسیار تسهیل شده است. توسعه چنین رسانه هایی با تحقیقات پیشگامانه مایکل (۱۹۸۹-۱۹۸۳) در مورد غنی سازی مواد مغذی و با کار آلن و نلسون (۱۹۱۰) در رسانه های دریایی مصنوعی سرچشمه گرفت. این دستور العمل های رسانه های مصنوعی در دوره مدرن عمدتاً با تلاش های گیلارد ، دورپ ، مک لوگلین ، Provasoli و همکارانشان اصلاح شده است ، و اکنون قادر به حمایت از رشد اکثر جلبک های پلانکتونی هستند. بهترین و معروف ترین و پرکاربردترین دستور العمل غنی سازی مواد مغذی ، غنی سازی “f” است که به طور معمول با استفاده از نیمه مقاومت (f / 2) گیلارد و رایتر (۱۹۶۲) استفاده می شود. پیشرفت قابل توجه در توسعه رسانه های مصنوعی ، افزودن ویتامین ها و مواد کلاتی کننده به جای عصاره های خاک تعریف نشده، بود. معرفی عوامل چلات کننده مصنوعی ، به ویژه EDTA ، در رسانه های کشت جلبک توسط هاتنر (هاتنر و همکاران ۱۹۵۰) به محققان این امکان را داد تا شیمی فلزات ردیابی را تعریف کنند و اساس کلیه کارهای مدرن در زمینه فیزیولوژی فلزات ردیابی فیتوپلانکتون را فراهم می کند. با توجه به آزمایشاتی که نشان دهنده تحریک رشد فیتوپلانکتون در آبهای اقیانوسی با افزودنی های آهن است ، علاقه به ردیابی فلزات ردیابی فیتوپلانکتون دوباره احیا شده است (Subba Rao and Yeats 1984؛ Martin and Fitzwater 1988). مکانیسمهای دقیق بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی که توسط آنها فیتوپلانکتون با محدودیت فلز سازگار می شود و از آهن یا سایر محدودیت های فلزات ردیابی می شود ، مشخص نیست و نیاز به کشف است. بدیهی است که فرضیه های دقیق مکانیکی و تکنیک های جدید برای ارزیابی محدودیت فلز در دریا از آزمایش های دقیق آزمایشگاهی ناشی می شوند.

چند سال پیش گروه تحقیقاتی ما با همکاری R. R. L. Guillard محیط آبزیان تعریف شده آبزیان را برای استفاده در مطالعات فلزات ردیابی فیتوپلانکتون توسعه دادند (مورل و همکاران ۱۹۷۹). نیاز به چنین واسطه ای بوجود آمد زیرا آشکار شد که در دسترس بودن بیولوژیکی و سمیت فلزات اثرگذار با خاصیت شیمیایی آنها ، بویژه با فعالیت های یون آزاد آنها تعیین می شود (ساندا و گیلارد ۱۹۷۶ ؛ اندرسون و مورل ۱۹۷۸). بنابراین ، کنترل و دستکاری مشخصات فلزات ردیابی برای تحقیقات فلزات فیتوپلانکتون-ردیابی حیاتی بود. همانطور که ما طی چند سال گذشته میزان استفاده از فلزات ردیابی و سمیت موجود در فیتوپلانکتون های دریایی را مورد مطالعه قرار دادیم ، ما شروع به بهبود درک نظری و عملی خود در مورد کشت فیتوپلانکتون تحت انواع محدودیت های فلزی کردیم. تجربیات ما ممکن است برای دیگران که قصد مطالعه ردیابی تغذیه فلزی فیتوپلانکتون را دارند مفید باشد. هدف اول ما توصیف تغییرات پروتکل اصلی و ارائه تکنیک هایی است که اکنون در آزمایشگاه ما برای تهیه Aquil استفاده می کنیم. ما همچنین می خواهیم در مورد پیشرفت های اخیر در درک ما از شیمی متوسط ​​و اینکه چگونه این ممکن است در تحقیقات فلزات ردیابی فیتوپلانکتون تأثیر بگذارد ، بحث کنیم.

ترکیب و آماده سازی متوسط
مانند سایر رسانه های کشت مصنوعی ، Aquil از نمک های درجه رجنتس تهیه شده است ، به گونه ای ترکیب می شود که از عناصر معدنی آب دریا طبیعی بدون گلبوستوف آلی محلول ناشناخته استفاده شود. سنتز آن به سه بخش تقسیم می شود: (۱) آماده سازی چلکس ، (۲) آماده سازی متوسط ​​و (۳) عقیم سازی و دستکاری. این مراحل در تهیه Aquil در بخش های بعدی به تفصیل بیان شده است. برای از بین بردن آلاینده های فلزی غیرمستقیم موجود در مواد شیمیایی درجه تجزیه و تحلیل شونده مورد استفاده در تهیه Aquil ، جزء آب مصنوعی اقیانوس (SOW) و سایر مواد مغذی دیگر ، به استثنای غنی سازی فلزات ویتامین و EDTA ، از طریق ستون حاوی رزین تبادل یونی. رزین ، چلکس ۱۰۰ (مش ۲۰۰-۴۰۰ ؛ آزمایشگاههای Bio-Rad ، ریچموند ، کالیفرنیا) ، از یک ماتریس استایرن دیوینیل بنزن مشتق شده با ویژگی های ایمینودایستات تشکیل شده است که ترجیحاً یک کللیت را با فلزات انتقال (مثل آهن ، مس ، روی) مشتق می کنند. ، Ni ، Cd ، Co) ، در نتیجه آنها را از محلول خارج می کند زیرا محیط از طریق ستون نفوذ می کند. با این حال ، قبل از استفاده از آن ، رزین را باید با دقت درمان کرد تا مواد آلی که ممکن است از ستون خارج شود و در حالت آماده سازی جمع شود ، خارج شود. این ترکیبات به احتمال زیاد شامل ایمینودایستات رایگان بوده و بنابراین لیگاندهای اتصال دهنده فلزی قوی هستند. در حقیقت ، هنگامی که مس از ستون تازه آماده چلکس به Aquil اضافه می شود ، حضور آنالیز کننده های قوی با تجزیه و تحلیل آمپرومتری تشخیص داده می شود (شکل ۱). تصفیه بیشتر Chelex اثبات قابل اندازه گیری از این مواد اتصال دهنده فلز را از بین می برد. حضور این ماده اتصال دهنده فلز قابل جدا شدن نه تنها منحنی های تیتراسیون فلز را مختل می کند ، بلکه رشد جلبک ها را نیز مهار می کند. ما مشاهده كرديم كه در محيط Aquil تحت درمان با Chelex ناخوشايند ، كه در اصل حاوي w-zo.6 M يا ۱۰/۱۹ · ۶ M یون آزاد آهن است ، سرعت رشد Thalassiosira weissflogii به ترتيب تنها ۰٫۴۱ يا ۱٫۰۶ d-1 است.
با این حال ، هنگامی که این محیط با تابش اشعه ماوراء بنفش تابش می شود تا مواد آلی اکسیداسیون شود ، حداکثر سرعت رشد ۱٫۴۴ و ۱٫ ۸۵ d-1 مشاهده می شود. توجه كنید كه تأثیر مواد اتصال دهنده فلز در شرایط كم آهن (PFe = 20.6) برجسته تر است زیرا پیچیدگی آن در دسترس بودن آهن برای رشد را محدود می كند. برای جلوگیری از این مشکلات احتمالی ، ما یک روش شستشوی دقیق تر برای چلکس ۱۰۰ را نسبت به آنچه در دستور العمل اصلی Aquil پیشنهاد شده است ، اتخاذ کرده ایم. این پروتکل به طور موثری لیگاندهای اتصال دهنده فلز را از رزین جدا می کند (جدول ۱). ستون SOW باید بیشتر از ستون مواد مغذی تغییر یابد زیرا در گذشته ناخالصی های فلزی کمتری وجود دارد. شستشوی ۳ M NH40H در مرحله ۴ به طور هم زمان غلظت بالایی از NH4 در رزین را معرفی می کند. اگر رزین کاملاً شستشو شود ، غلظت NH4 + در آب دهنده می تواند به راحتی به سطح پس زمینه کاهش یابد (<0.1 t-tM).

محیط کشت COMBO برای تهیه یک ماده آب شیرین تعریف شده مناسب برای کشت هر دو جلبک و دافنیید ساخته شد. تعدادی از انتخاب ها در آهنگسازی COMBO انجام شد و استدلال را در اینجا شرح می دهیم. عناصر اصلی شامل هفت یون اصلی آب شیرین طبیعی (Ca2C، Mg2C ،NaC ،KC ،HCO3- ،SO4 2− و Cl−) و همچنین عناصر اصلی مواد مغذی (N ،P ،Si ،B) داخل محیط کشت می باشد. غلظت این عناصر همانند محیط گیلارد است. تفاوت در ترکیب عناصر از فراکویل به شرح زیر است: فراکویل تنها ۲۰٪ K و Na، تنها ۱۰٪ N ،۱۲٫۵٪ Si و B ندارد. اما ۲ برابر P اختلاف دارد. محیط ASM به شرح زیر است: دارای Na ،Cl و Mg بسیار بیشتر است.

مواد داخل محیط های تجاری و غیر تجاری مختلف

محیط کشت جلبک دریایی مقادیر مشابهی از Ca، دو برابر K ،P و N دارد اما فاقد مقادیر اضافی Si ،B و HCO3 – است. تفاوت آن با DYIII به شرح زیر است: DYIII دارای دو برابر Ca و یک سوم بیشتر منیزیم است اما سدیم پایین (فقط ۲۰٪) و K (فقط ۴۰٪) و مواد مغذی پایین (اما شامل Si و B) نیز دارد. محیط کشت دریایی زئوپلانکتون معمولی غلظت مواد مغذی اصلی کمتری را در مقایسه با محیط های کشت جلبکی دارند. غلظت عناصر سازنده در محیط COMBO برای کشت هر دو جلبک و زئوپلانکتون مناسب است. یک مورد مهم در ابداع محیط کشت جلبک COMBO نسبت Ca: Mg بود. بکر گزارش داد که جلبکها طیف گسترده ای از نسبت های Ca: Mg را تحمل می کنند. با این حال لیمن تعیین کرد که رشد دونوبریون سرتولاریا مطلوب است که نسبت مولی Ca: Mg 2: 1 بود. برای زئوپلانکتون نسبت مولی Ca: Mg از محیط MS برابر با ۳٫۲: ۱ و نسبت الندت و بیاز  به ۴: ۱ است که هر دو نسبت به سایر محیط کشت ها کمی بیشتر هستند. این محیط های آب سخت در اصل برای کشت Daphnia magna گونه ای سازگار برای زیستگاه های آب سخت طراحی شده بودند. همانند محیط کشت این و فراکویل نسبت مولی Ca: Mg از COMBO برابر ۱٫۷: ۱ است.

کشت دوگانه

از آنجا که محیط کشت COMBO در آزمایشگاه ما با فرهنگ D. magna و همچنین D. pulicaria و Ceriodaphnia dubia با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته است ، ما دریافته ایم که نسبت مولی Ca: Mg از COMBO برای کشت دوگانه یک مجموعه گسترده از جلبک ها و زئوپلانکتون مناسب است. در آزمایش COMBO ، محققان دیگر نیز تولید مثل بسیار خوبی را توسط Daphnia pulex ، D. pulicaria ، D. galeata mendotae ، D. lumholtzi و D. magna گزارش داده اند و مهمتر اینکه این محیط کشت ها بیش از دو سال در COMBO حفظ شده اند (S. دودسون pers. com). سایر cladocera هایی که با موفقیت در COMBO پرورش یافته اند عبارتند از Bosmina longirostris (K. Schulz pers. com) و Diaphanosoma (R. Sterner pers. com.) و علاوه بر کلادوکران ها ، آزمایشگاه ما در COMBO نیز دارای پلاتاریا و روتیفرهای مختلط است.

تاثیر های مثبت و منفی رقیق سازی محیط کشت

برخی محققان اظهار داشته اند كه محیط کشت COMBO می تواند به همان اندازه مؤثر باشد كه ۵۰٪ با آب مقطر رقیق شود (S. Dodson pers. com) اما ما این رقیق سازی بستر کشت را برای گونه های آب سخت مانند D. magna توصیه نمی كنیم. غلظت K از COMBO (3.9 میلی گرم لیتر-۱) در محیط زئوپلانکتون کیتینگ (۱۹۸۵) (۹٫۸ میلی گرم L-1) و کمی بیشتر از آن در محیط کشت ابداع شده توسط الندت و بایاس (۱۹۹۰) بسیار پایین است. ۳/۳ میلی گرم لیتر در ۱). غلظت K پایین تر را انتخاب کردیم زیرا شناخته شده است که برای زئوپلانکتون مناسب است (یعنی الندت و بایاس ۱۹۹۰) ، و به اندازه کافی زیاد نیست که برای بیشتر جلبک ها سمی باشد. با این وجود ، کسانی که مایل به رشد گلبولهای طبیعی هستند ، می توانند نتایج لمن (۱۹۷۶b) را در نظر بگیرند که دریافتند K به سمیته داینوبریون بالاتر از ۵ میلی گرم لیتر از ۱ میلی گرم سمی تبدیل شده است. . com.) این گونه قبلاً با موفقیت در محیط کشت WC با نیمی از عناصر کمیاب معمولی و ۲۵ M P (کلوونز و گیلارد ۱۹۷۵) کشت داده شد. ما همچنین در COMBO گونه های بیشماری از سیانوباکتری ها ، Cryptophytes ، جلبک های سبز و دیاتوم ها را حفظ کرده ایم. در جدول ۵ حداکثر سرعت رشد جلبکهای انتخاب شده در محیط COMBO و شرایط کشت مربوطه ذکر شده است. جلبکهای دیگر شامل Staurastrum sp. ، Diogenes sp. ، Selenastrum sp. ، Cryptomonas ovata و Cryptomonas reflexa هستند. محققان دیگر از COMBO برای رشدChlamydomonas ، Selenastrum (S. Dodson ، pers. com.) ، Scenedesmus acutus (R. Sterner ، pers. com) و Chlamydomonas reinhardii استفاده کرده اند (K. Schulz ، pers. com). COMBO ثابت شده است که یک محیط کشت عالی برای آزمایشات دستکاری مواد مغذی و جلبک و زئوپلانکتون است (کیلام و همکاران ، ۱۹۹۷a ؛ کیلام و همکاران ، ۱۹۹۷ ب ؛ اروبه و همکاران ، ۱۹۹۷). زیرا P تحویل است.

چگونه میزان عناسر محیط کشت را دستکاری کنیم؟

از آنجا که در محیط کشت میکرو جلبک P به عنوان K2HPO4 تحویل داده می شود، هنگام کاهش غلظت فسفر COMBO برای استفاده در چنین آزمایشات دستکاری توصیه می کنیم غلظت K را با KCl (جدول ۱A) تکمیل کنید. Cl اضافه شده قابل توجه نیست. به همین ترتیب ، زیرا N به طور عمده به عنوان NaNO3 تحویل داده می شود. هنگامی که COMBO برای آزمایش های کم N آماده می شود ، سطح Na نیز پایین می آید ، اما مانند Cl ، این بعید است که مشکلی ایجاد کند (Becker 1994). عناصر ردیابی محیط کشت COMBO دارای دو عنصر عنصر کمیاب متفاوت است. عناصر کمیاب جلبک (ATE) شامل EDTA ، Fe و هفت عنصر جزئی هستند. عناصر کمیاب حیوانات (ANIMATE) شامل پنج عنصر جزئی جزئی دیگر است. از نظر كمبود و مسموميت براي برخي عناصر جزء محدوده محدودي وجود دارد و مطالعات دقيق تر در اين زمينه براي جلبك هاي آب شيرين مطلوب خواهد بود. یک راه حل مناسب برای عناصر کمیاب محیط کشت باید غلظت کافی را برای جلوگیری از محدودیت در زیست توده با جلبک زیاد فراهم کند. اما در زیست توده کم به سمیت نزدیک نشود.

مزیت و مشکلات جذب فلزات توسط جلبک ها

جلبک ها می توانند فلزات را تا حد زیادی متمرکز کنند (۱۰۰۰ برابر) با این حال غلظت بالای فلز در جلبک ها می تواند برای حیواناتی که آنها را می خورند مضر باشد. بنابراین باید بین کمبود و سمیت تعادل برقرار شود. مورل مخلوط عنصر کم ردیابی فراکول را طراحی کرد تا از نظر ترمودینامیکی میزان بارش مواد جامد در محیط کشت دریایی را کاهش دهد. اگرچه شرایط تعادل ترمودینامیکی باعث بارندگی می شود. میزان آنقدر پایین است که برای اهداف عملی مهم نیست. سطح EDTA (جدول ۲) همانند WC است (۱۱٫۷ M؛ Fraquil = 5.0 M؛ ASM و DY Ill از WC بالاتر هستند؛ کیتینگ بالاتر است و الندت و بیاس پایین تر است). نسبت شلات: فلز تقریباً ۲٫۴: ۱ به عنوان ایده آل پیشنهاد شده است (کلر و همکاران ، ۱۹۸۷). غلظت آهن همان مقدار در ASM ، پایین تر از WC (35٪) است ، اما کمی بیشتر از Fraquil ، DYIII ، یا محیط کشت های Keating (MS) یا Elendt و Bias (M-4) است. غلظت انتخاب شده یک سازش است ، زیرا آهن یک عنصر اصلی سوخت و ساز بدن است ، به خصوص برای سیتوکروم ها ، سنتز رنگدانه و متابولیسم نیتروژن. هفت عنصر جزئی مورد نیاز جلبک ها (ATE) areMn ، مس ، روی ، Co ، Mo ، Se و V هستند.

تعدادی از محیط کشت های تعریف شده آب شیرین وجود دارند که برای کشت طیف وسیعی از جلبک ها بکار مفید هستند. اما برای کشت زئوپلانکتون هایی مانند دافنید ها کافی نیستند. برای انجام آزمایش ها روی روابط بین حیوانات و ارگانیسم های غذایی، گسترش بستر کشت هایی که هم رشد جلبک ها و هم رشد زئوپلانکتون را بدون نیاز به تغییر محیط کشت جلبک به صورت اختصاصی چه برای جلبک چه زئوپلانکتون، پشتیبانی کند مهم است.

انواع محیط های آب شیرین

محیط کشت های آب شیرین زیادی طراحی شده اند اما چهار عدد از آن ها بصورت گسترده در حال استفاده اند: گویی لارد، فراکویل، ASM و DYIII. اصلاحات بیشماری برای یک و چند تا از این بسترکشت ها انجام شده تا برای نیازهای خاص مناسب باشند. گروهی از محققان محیط های مصنوعی ابداع کردند که از دستور العمل های مورفی و داویدوف و کالین و پروواسولی گرفته شده اند. این محیط کشت ها برای کشت گونه های دافنی در شرایط تعریف شده برای استفاده در ازمایش های تغذیه و سم شناسی استفاده می شوند. با این حال به دلیل محتوای گلایسیل گلیسین آن ها کشت ها باید حساس باشند که این برای استفاده های روزمره غیر عملی می باشد.

محیط کشت M4

محیط کشت M4 که یک محیط آب سخت است توسط سازمان همکاری اقتصادی و توسعه برنامه های سم شناسی در اروپا تایید شده است. این بستر مخصوصا برای استفاده برای کشت D. magna مفید است اما M4 نمی تواند جلبک ها را به موفقیت حفظ کند. سازمان حفظ محیط زیست در ایالت متحده امریکا استفاده از آب دوباره تجدید شده را توصیه کرده است. چهار محیط کشت زئوپلانکتون ساده نمکی برای مطاله روی سمیت ماهی ها تولید شده است. این محیط کافی نیست چرا که فاقد عناصر ضروری می باشد. دافنی ها می توانند روی چنین محیطی با اضافه کردن آب فیلتر شده دریاچه و یا آب معدنی پریر زشد کنند اما این کار هدف از داشتن یک بستر کشت تعریف شده برای مطالعات ازمایشگاهی را خراب می کند.

محیط کشت COMBO

ما یک محیط کشت به نام COMBO تولید کردیم که رشد عالی هم جلبک ها و هم زئوپلانکتون ها را پشتیبانی می کند. دو نوع جلبک در این بستر کشت و هم چنین محیط گوییلارد کشت داده شدند و سرعت رشد آن ها با یک دیگر مقایسه شد. یکی از جلبک ها که  Ankistrodesmus falcatus بود، سپس برای تغذیه یک کلادوسران به نام Daphnia pulicaria که آن هم روی محیط کشت COMBOکشت داده شده بود استفاده شد. نتیجه باروری این زئوپلانکتون با آب های سحطی طبیعی مقایسه شد. ما هم چنین تعیین کردیم که آبا مقدار COMBO به عنوان یک مدیوم کشت برای این کلادوسران به وسیله اصلاح در لظت فسفر و یا نیتروژن تحت تاثیر قرار می گیرد یا نه تا ببنیم آیا محیط کشت جلبک و زئوپلانکتون جدید برای تحقیق های تغذیه مناسب است یا نه. نتایج ما با نتایج سایر محققان بحث شده است که با موفقیت از COMBO برای کشت استفاده کرده اند بسیاری از گونه های دیگر جلبک و زئوپلانکتون.

محیط کشت ها برای کشت جنین های انسانی در شرایط آزمایشگاهی به دور از فرمولاسیون های کشت سلولی به سمت فرمولاسیون های متوالی مرحله خاص جهت تسهیل در ارائه داروهای مختلف، اجزای تشکیل دهنده جنین در طی فعال سازی قبل و بعد از تکامل تکامل یافته اند. بسیاری از فرمولاسیون ها پی در پی تجاری برای استفاده خاص از مرحله وجود دارد و اخیراً دو فرمولاسیون محیط کشت طراحی شده اند که به عنوان یک بستر کشت واحد برای ارائه کلیه مؤلفه ها در جنین در طی تمام مراحل پس از باروری در توسعه آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می گیرند.

عوض کردن محیط کشت در طول پروسه پرورش جنین

انتقال جنین ها به داخل ظروف جدید یا تازه کردن محیط کشت جنین در فواصل زمانی به عنوان روشی برای جلوگیری از قرار گرفتن در معرض جنین ها در ساخت بالقوه آمونیوم از تجزیه اسیدهای آمینه یا ترکیبات جوی فرار پیشنهاد شده است. بستر کشت های منفرد (گاهی اوقات به عنوان بستر کشت های تک کشت) نیز گفته می شوند که برای فراهم کردن تمام اجزای جنین در همه زمان ها طراحی شده اند. یک محیط کشت مدرن تک کشت برای محدود کردن ساخت آمونیوم با جایگزینی گلوتامین با فرم پایدارتر می تواند برای کشت مداوم بدون وقفه جنین های انسانی مورد استفاده قرار بگیرد.

انتقال جنین ۳ روزه

برای انتقال جنین های داخل محیط کشت ۳ روزه جنین ها برای تعداد سلول و مورفولوژی گلزنی شدند (نمره Q1-5 ، ۱ بهترین). جنین ها در محیط متوالی سپس به محیط متوالی دوم منتقل شدند. جنین ها در محیط تک بدون تجدید میکرودروپ ها در ظرف اصلی باقی مانده بودند. انتخاب جنین برای انتقال بر اساس تعداد سلول و نمره كیفیت صرف نظر از درمان محیط کشت انسانی انجام شد. بلافاصله قبل از انتقال جنین های منتخب به تقریباً ۳ میلی لیتر ۳۶ درجه سانتیگراد کوین منتقل شدند. دلیل استفاده از این محیط برای انتقال جنین ثبات pH است که در صورت انتقال جنین بیشتر از زمان پیش بینی شده توسط بافر هپس ارائه می شود. کاتتر با حجم کمی از محیط کشت شسته شد و جنین ها در نوک سوند در حجم تقریباً ۱۵-۱۵ میلی لیتر واقع در بین دو حباب هوا کوچک آسپیر شدند. انتقال جنین با استفاده از راهنمایی سونوگرافی انجام شد. ظروف دارای جنین هایی که منتقل نشده بودند به شیشه شیشه ای برگردانده شدند که در مرحله بعد به شرح گازی شد و برای کشت به روز ۵ و / یا ۶ برای ارزیابی برای انجماد به انکوباتور برگشت داده شد (بلاستوسیست های گسترش یافته با توده سلولی آشکار).

انتقال جنین های ۵ روزه

برای انتقال جنین های محیط کشت انسانی روز ۵ جنین ها به طور خلاصه در صبح روز ۳ مشاهده شدند. اما نمرات کیفی به آنها اختصاص نیافته بود. جنین ها در محیط پی در پی به محیط متوالی دوم منتقل شدند. جنین ها در تیمار متوسط ​​تنها بدون تجدید میکرودروپ ها در ظرف اصلی باقی مانده اند. ظروف به شیشه مطابق با توضیحات گازی برگردانده شدند و برای ادامه رشد در محیط کشت تا روز ۵ به دستگاه کشت برگشت داده شدند. در روز ۵ جنین در هر دو ظرف به مرحله رشد و مورفولوژی ذهنی (نمره بلاستوسیست Q1 به Q3 ، ۱) رسید. بهترین بودن ؛ جنین هایی که دارای رشد اولیه بلاستوسل و بدون شناسایی توده سلولی درونی هستند به عنوان بلاستوسیست های اولیه بدست آمدند). انتخاب جنین در هر محیط کشت برای انتقال بر اساس نمره كیفیت بدون در نظر گرفتن كشت درمان متوسط ​​انجام شد. انتقال جنین همانطور که در بالا توضیح داده شد انجام شد. جنین هایی که برای سرمازدگی فوری انتخاب نشده اند (بلاستوسیست های جوجه کشی کاملاً گسترش یافته با توده سلولی درونی در روز ۵ تبخیر شد) به ظرف شیشه ای بازگردانده شدند. همانطور که شرح داده شد گازی شده و برای ادامه کشتدر محیط کشت تا روز ۶ و ارزیابی برای انجماد به انکوباتور بازگشتند. جنین های بارور شده در هر بیمار هر طور که به طور تصادفی به هر یک از محیط های تزریق کشت اختصاص داده شد تا از تغییرات تجربی بین بیماران کاسته شود. داده های رشدی در هر درمان (سیستم کشتی) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اما بین روز انتقال جنین با استفاده از آزمون t زوجی و آزمون رتبه قرار نگرفت. مشخصات بیمار و چرخه نتایج حاملگی و داده های رشد جنین خواهر و برادر با توجه به روز انتقال جنین در درمان محیط کشت انسانی وجود دارد.

مقایسه میانگین روزهای کشت

برای انتقال جنین سه روز کشت به محیط کشت جدید میانگین تعداد جنین های ۶ سلولی بهترین است. میانگین تعداد جنین برای انتقال از هر رسانه انتخاب شده و میانگین نمرات کیفیت جنین انتقال یافته بود. بین دو سیستم فرهنگ تفاوت معنی داری وجود ندارد. علاوه بر این تعداد جنین های فوق طبیعی در حال توسعه به مرحله بلاستوسیست برای حفظ سرمازدگی بین رسانه ها تفاوت معنی داری نداشت.

مقایسه تعداد بلاستوسیست ها در روز کشت های مختلف

در مورد انتقال جنين در روز ۵ به محیط کشت انسانی جدیدتر ميانگين تعداد بلاستوسيست ها در روز ۵ در محيط متوسط ​​در مقايسه با کشت هاي متوالي به طور معني داري بالاتر بود و تعداد قابل توجهي بالاتر از بلاستوسيست ها براي انتقال از محيط واحد انتخاب شدند. گرچه میانگین نمرات کیفیت جنین های انتخاب شده برای انتقال به محیط کشت تازه مشابه بودند. یک سیستم درجه بندی صریح تر برای بلاستوسیست ها (۱۶ ، ۱۷) ممکن است تصویری دقیق تر از روند انتخاب مشاهده شده در این مطالعه را ارائه دهد. در ۲۲ مورد از ۴۴ انتقال (۵۰٫۰٪) ۵ مورد از ۴۴ انتقال (۴/۱۱٪) از رسانه هاي متوالي فقط ۱۷ و ۴۴ مورد از ۴۴ انتقال (۶/۳۸٪) از تنها رسانه ها را براي انتقال از هر دو رسانه انتخاب كردند. میانگین تعداد بلاستوسیستهای موجود در روز ۵ در محیط کشت واحد به طور معنی داری بیشتر است. پشتیبانی از این ایده که یک رسانه واحد می تواند انجام دهد و همچنین کشتهای پی در پی. نتایج این مطالعه همچنین نشان می دهد که استفاده مداوم از یک رسانه واحد بر رشد جنین تأثیر منفی نمی گذارد. همانطور که توسط دیگران پیشنهاد شده و نشان داده شده است (۶-۹). در این مطالعه هیچ تلاشی صورت نگرفته است که به طور هدفمند از هر درمان جنین منفرد انتخاب شود بلکه بهترین جنین ها صرف نظر از درمان برای جایگزینی انتخاب می شوند. با این حال برای مطالعه بیشتر روی محیط کشت جنین احتمال استفاده از دو (یا چند) کشت متفاوت وجود دارد.

پروتکل منفرد کشت جنین

محیط کشت ها در یک پروتکل کشت جنین خواهر و برادر با اجازه دادن جنین در داخل هر بیمار به انتخاب “کدام” از بین دو بستری که ترجیح می دهند نرخ کاشت بالاتر را ارتقا می دهند. از مزایای پروتکل منفرد مداوم موفق می توان به کاهش پتانسیل برای از بین رفتن جنین و / یا معرفی آلاینده ها از طریق خطاهای دست زدن، کاهش استرس جنینی از جمله کاهش دما و نوسانات یا حتی پیپتینگ جنین اشاره کرد. گرچه کاهش در هزینه مصالح مورد استفاده از اهمیت محدودی برخوردار است. لازم به ذکر است که اگر آزمایشگاه یا محیط کشت کمتر از حد مطلوب باشد ، آزمایش مداوم بدون وقفه ممکن است کمتر موفقیت آمیز باشد ، زیرا ممکن است در طول دوره کشت ترکیبات آلی فرار و محلول در آب و یا آب حل شونده وجود داشته باشد. داده های ارائه شده در اینجا حاکی از آن است که با کنترل دقیق محیط محیط کشت ، به عنوان مثال ، با استفاده از کوزه های شیشه ای آب بندی شده ای که به اتمسفر خاص گاز مجهز شده اند ، ممکن است این نگرانی به حداقل برسد. این مطالعه نشان می دهد که هیچ گونه مزیت آشکاری در استفاده از بسترهای پی در پی بر روی یک محیط واحد وجود ندارد و محیط کشت ناشر بدون وقفه می تواند از نظر رشد جنینی و نتایج بالینی موفقیت آمیز باشد. اگر شرایط آزمایشگاهی از نزدیک مورد بررسی قرار گیرد و از اقدامات احتیاطی در برابر نوسانات جوی استفاده شود. همچنين نياز به مطالعات دقيق تري را براي به چالش کشيدن آنچه در نظر گرفته مي شود پذيرفته شود ، يا روش هاي فرهنگي جنيني سنتي باشد ، تأکيد مي کند.