Leave a comment

محیط کشت اکسیداتیو

تجزیه اکسیداتیو سلولز
این فرضیه مبنی بر اینكه سیستم تجزیه ای كه توسط پایه های پوسیدگی چوب مورد استفاده قرار می گیرد برای تخریب پلی ساکاریدهای دیواره سلولی گیاه نیز مورد استفاده قرار می گیرد ، شامل یک مؤلفه غیر بنزامی نیز می باشد که قبلاً ۴۰ سال پیش تدوین شده است (هالیویل ، ۱۹۶۵ ؛ کوئنیگ ، ۱۹۷۴). تشخیص پراکسید هیدروژن (H2O2) تولید توسط چندین قارچ منجر به پیشنهاد مسیر تخریب بر اساس واکنش فنتون H2O2 þ Fe2þ-Hþ! H2O þ Fe3þ þ OH
این واکنش یک مسیر شناخته شده از تولید OH در سیستم های بیولوژیکی است. H2O2 توسط قارچهای پوسیدگی سفید با عملکرد آنزیم هایی مانند گلیوکسال اکسیداز (Kersten & Kirk، ۱۹۸۷) ، گلوکز اکسیداز (کلی و رددی ، ۱۹۸۶) و آریل الکل اکسیداز تولید می شود (Guill´en et al.، ۱۹۹۰؛ Muheim et همکاران ، ۱۹۹۰) ، و همچنین توسط قارچ های پوسیدگی قهوه ای (Ritschkoff & Viikari، ۱۹۹۱). علاوه بر رادیکال های آزاد OH ، برخی از آهن های بیش از حد که در آن رادیکال ها با آهن همراه هستند نیز توسط برخی از نویسندگان به عنوان عوامل اکسید کننده بالقوه در نظر گرفته شدند (Wood، ۱۹۹۴؛ Branchaud، ۱۹۹۹؛ Welch et al.، ۲۰۰۲a، b). اگرچه آهن در اکثر سیستمهای بیولوژیکی برای جلوگیری از آسیب اکسیداتیو به طور کلی در مجتمع های غیرفعال کننده ردوکس توقیف می شود (Halliwell & Gutteridge، ۱۹۹۹) ، این چوب برای چوب وجود ندارد ، جایی که غلظت کافی آهن باعث می شود که تولید OH امکان پذیر باشد (Koenigs، ۱۹۷۴) ، به شرط آنکه چولاتورها یا کاهنده ها برای حل این فلز در دسترس هستند. با این حال ، از آنجا که Fe21 معمولاً در محیط اکسیژن دار وجود ندارد ، این سؤال وجود دارد که چگونه کاهش لازم Fe31 حاصل می شود.

Leave a comment

محیط کشت آنزیم سلولاز

تخریب فسفروولیتیک سلولهای الیگوساکاریدها
اگرچه تخریب فسفرولیتیک در محیط کشت سلولاز دار برای پلی ساکاریدهای دارای پیوندهای ۱ -۴ معمولی تر است. چندین گونه باکتریایی آنزیم هایی دارند که قادر به جدا کردن سلوبیوز یا سلوکسترون ها توسط واکنشهای فسفرولیتیک Pi- واسطه (ATP مستقل) از سلولزی و فسفوریلازهای سلوکستسترین هستند. به دلیل محلی سازی داخل سلولی آنزیم ها این واکنش در هیدرولیز سلولز دخیل نیست بلکه بخشی از کاربرد داخل سلولی الیگوساکاریدها است. فسفوریلاز سلوبیوز (EC 2.4.1.20) برای قارچها مورد غربالگری قرار نگرفت. اما گهگاهی در پاتوژن ریشه پوسیدگی سفید Heterobasidion annosum کشت داده شده در محیط کشت آنزیم دار تشخیص داده شد. این قارچ به دلیل داشتن فسفرولیز صرفه جویی در انرژی رشد بیشتری در سلوبیوز نسبت به گلوکز نشان داد.

Leave a comment

محیط کشت بتا گلوکوزیداز

بتا- گلوکوزیداز

از آنجا که سلوبی یک بستر در دسترس است بتا گلوکزیدازهای داخل محیط کشت توسط اکثر میکروارگانیسم ها تولید می شوند. از بین بنیادیومایست ها آنزیم ها از چندین قارچ پوسیده چوبی، پوسیدگی سفید و پوسیدگی قهوه ای، قارچ های مایکوریزا Pisolithus tinctorius و Tricholoma matsutake و پاتوژن گیاه Sclerotium rolfsii و Termitomyces sp جدا شدند. بتاگلیکوزییدازها نیز از مخمرهای بادیومایستی جدا شده و فعالیت آنها در آنها مشاهده شد. اگرچه برخی از مخمرهای چوبی قادر به استفاده از سلوبیوز محیط کشت به عنوان بستر نبودند. فعالیت بتا-گلوکوزیداز همچنین در کشتهای خالص پایه های تجزیه کننده بستر آشکار شد و گونه های اکتومایکوریز. بتا گلوکوزیدازهای جدا شده تاکنون دارای تنوع ساختاری بالایی هستند که تا حدودی منعکس کننده محلی سازی داخل سلولی / خارج سلولی آنزیم می باشد.

جرم های مولکولی بتا-گلوکوزیداز

جرمهای مولکولی ماده موثر محیط کشت بتا گلوکوزیداز شناسایی شده بین ۳۵ تا ۶۴۰ کیلو دالتون است. در حالی که آنزیمهای کوچک با جرمهای مولکولی در حدود ۱۰۰ کیلو دالتون مونومر و معمولاً خارج سلولی هستند. آنزیم های همو الیگومریک نیز جدا شده اند. مخمرهای Rhodotorula و Sporobolomyces singularis ،bglycosidases وابسته به دیواره سلولی و دارای میل ترکیبی بالا برای p-nitrophenyl-b-D- گلوکوزید (pNPG) و فعالیت ترانس گالاکتوزیداز تولید می کنند. آنزیم ها همچنین قادر به جدا شدن واحدهای گالاکتوز و فوکوز و دی سکاریدهای لاکتوز  در بستر محیط کشت بتا گلوکوزیداز هستند. اما KM برای pNPG کمترین است و از این رو می توانند به عنوان b-glukosidases تعیین شوند. آنزیم مربوط به دیواره سلولی از Pisolithus tinctorius یک homotrimer است و ۴۵۰ کیلو دالتون b-گلوکزیداز از Termitomyces clypeatus از زیر واحد ۱۱۰ کیلو دالتونی تشکیل شده است. از طرف دیگر گلوکزیداز بزرگ ۳۰۰ کیلو دالتونی از Trametes Versicolor یک گلیکوپروتئین مونومر با ۹۰٪ گلیکوزیلاسیون است. ساختار کواترنر آنزیمهای بزرگ داخل سلول از Phryerochaete chrysosporium (410 کیلو دالتون) و Volvariella volvacea (256 کیلو دالتون) شناخته نشده است.

بتا گلوکوزیدازهای خارج سلولی و داخل سلولی

ب- گلوکوزییدازها به طور معمول گلیکوزیله داخل محیط کشت می شوند اما مقدار واحد قند متفاوت است. نقاط ایزوالکتریک آنزیم های مربوط به دیواره سلولی و خارج سلولی اسیدی هستند ، به طور معمول بین ۳٫۵ و ۵٫۲ در حالی که آنزیم های داخل سلولی دارای pI های ۶٫۲ تا ۷٫۰ هستند. همانطور که قبلاً نیز گفته شد ، β- گلوکوزیدازها می توانند خارج سلولی مرتبط با دیواره سلولی و داخل سلولی باشند. کسر مربوط به میسلیوم در Pleurotus ostreatus ، Trametes versicolor و Piptoporus betulinus به ترتیب ۶۵٪ ، ۱۳٪ و ۳۵٪ از فعالیت کل را به خود اختصاص داد. تنها ۱۰٪ از گلوکزیداز b در کشتهای Volvariella volvacea خارج سلولی بود در حالی که ۲۶٪ با کسر دیواره سلولی و ۶۴٪ در داخل سلول قرار داشتند.
محلی سازی داخل سلولی برخی از β- گلوکزیدازها نیاز به انتقال سلولوبیوز به داخل سلول دارد. اگرچه اثبات نشده است. این احتمال وجود دارد که یک permease مشابه Trichoderma reesei diglucoside permease نیز در بازیدیومیست ها عمل کند.

نقش آنزیم ها در تولید مولکول های ساختاری و کاتالیزگر

حضور آنزیم های خارج سلولی و داخل سلولی در محیط کشت در تولید مولکول های آنزیمی متفاوت در خواص ساختاری و کاتالیزوری منعکس می شود. در Phryerochaete chrysosporium آرایه ای از آنزیم ها با فعالیت B- گلوکزیداز به طور مستقل توسط چندین گروه جدا شد. کمترین پروتئین ۴۵ کیلو دالتونی خارج سلولی است و علاوه بر pNPG می تواند P-nitrophenyl-b-D-xylopyranoside (pNPX) و laminaribiose (پیوندهای B-1.3) را نیز بشکند. تقریباً با سلولز پلیمر و زایلان غیرفعال است. سه بتا گلوکزیداز خارج سلولی در محیط کشت رشد سلولزی یافت شد. آنزیم ۱۱۴ کیلو دالتونی حاوی CBD است که با درمان پاپین جدا می شود. پروتئین های ۹۶ و ۹۸ کیلو دالتونی که سلولز را به هم وصل نمی کنند. احتمالاً قطعات این مولکول بزرگتر هستند.

مهار فعالیت بتاگلوکوزیداز

فعالیت بتاگلوکوزیداز محیط کشت به طور رقابتی توسط گلوکز و گلوکونولاکتون مهار می شود. بلکه توسط سلوبیونولاکتون محصول اکسیداسیون CDH سلوبیوز نیز مهار می شود. آنزیم خارج سلولی ۱۱۶ کیلو دالتونی متعلق به خانواده ۳ گلیکوزیداز است. این ماده نسبت به سلوبیونازلاکتون (KM 1.29mM) و لامیناریبیوز (۲٫۰۳mM) در مقایسه با سلوبیوز (۳۵/۳ میلی متر) نسبتاً زیاد دارد اما کیلاتکت برای سلوبیونولاکتون ۷۶ نسبت به سلولوبیوز پایین تر است. سلوبیونلاکتون تولید شده در مقادیر زیاد توسط CDH بنابراین به طور مؤثر فعالیت آن را مهار می کند. مجموعه ای از آنزیم های خارج سلولی مونومریک با ۱۶۵-۱۸۲ کیلو دالتون از محیط کشت های در حال رشد بر روی سلولز جدا شدند.

نقش سلوبیوز در کنار بتا گلوکوزیداز

سلولیوز تنها فعالیت آنزیم محدود سلول با میل کمتر برای pNPG را ایجاد می کند – KM 2.0mM در مقایسه با ۰٫۱۵-۰٫۲۱mMreported در محیط کشت بتا گلوکوزیداز برای آنزیم های خارج سلولی. آنزیم داخل سلولی ۴۱۰ کیلو دالتونی به شدت توسط سلولوبیوز القا شد اما فقط توسط سلولز ضعیف است. گلوکز به عنوان سرکوبگر سنتز B- گلوکزیداز در Phryerochaete chrysosporium عمل کرد. دو بتا گلوکوزییداز داخل سلولی اخیراً مشخص شد که به خانواده گلیکوزیل هیدرولاز ۱ تعلق دارند. پروتئین های نوترکیب بیان شده در اشرشیاکلی دارای ۵۳ و ۶۰ کیلو دالتون هستند. BGL1A همچنین به عنوان b-xylosidase با KM شبیه به pNPG فعال است. ساختار بلوری آن حتی در شرایط محیط کشت به تازگی مشخص شده است.

توانایی بتا گلوکوزیداز در جداسازی واحدهای سازنده پلیمرها

همانطور که قبلاً برای Phanerochaete chrysosporium ذکر شد همچنین b-glukosidases از قارچ های پوسیدگی قهوه ای در محیط کشت نسبتاً غیر اختصاصی هستند و همچنین می توانند واحدهای زایلوس، مانوز و گالاکتوز را از الیگوساکاریدهای مربوطه جدا کنند. گرچه مقادیر KM بالاتری نیز دارند.فعالیت ب-گلوکوزیداز به طور رقابتی توسط گلوکز و گلوکونولاکتون مهار می شود ، بلکه توسط سلوبیونولاکتون ، محصول اکسیداسیون CDH سلوبیوز نیز مهار می شود. آنزیم خارج سلولی ۱۱۶ کیلو دالتونی متعلق به خانواده ۳ گلیکوزیداز است. این ماده تولید شده در محیط کشت نسبت به سلوبیونازلاکتون (KM 1.29mM) و لامیناریبیوز (۲٫۰۳mM) در مقایسه با سلوبیوز (۳۵/۳ میلی متر) نسبتاً زیاد دارد اما کیلاتکت برای سلوبیونولاکتون ۷۶ نسبت به سلولوبیوز پایین تر است. سلوبیونلاکتون تولید شده در مقادیر زیاد توسط CDH بنابراین به طور مؤثر فعالیت آن را مهار می کند.

نقش مجموعه آنزیم های خارج سلولی

مجموعه ای از آنزیم های خارج سلولی مونومریک با ۱۶۵-۱۸۲ کیلو دالتون از محیط کشت های در حال رشد بر روی سلولز جدا شدند. سلولیوز تنها فعالیت آنزیم محدود سلول با میل کمتر برای pNPG را ایجاد می کند – KM 2.0mM در مقایسه با ۰٫۱۵-۰٫۲۱mMreported برای آنزیم های خارج سلولی. آنزیم داخل سلولی ۴۱۰ کیلو دالتونی به شدت توسط سلولوبیوز القا شد اما فقط توسط سلولز ضعیف است. گلوکز به عنوان سرکوبگر سنتز B- گلوکزیداز در Phryerochaete chrysosporium عمل کرد. دو بتا گلوکوزییداز داخل سلولی اخیراً مشخص شد که به خانواده گلیکوزیل هیدرولاز ۱ تعلق دارند. پروتئین های نوترکیب بیان شده در اشرشیاکلی دارای ۵۳ و ۶۰ کیلو دالتون هستند. BGL1A همچنین به عنوان b-xylosidase با KM شبیه به pNPG فعال است. ساختار بلوری آن به تازگی مشخص شده است.

Leave a comment

محیط کشت سلوبیوهیدرولاز

قارچ های دارای سلوبیوز

سلولوبیو هیدرولاز سلوبی هیدرولازها تاکنون در محیط کشت سلوبیوهیدرولاز از چندین پایه بنیادی پوسیدگی سفید، گیاه پاتوژن گیاه Sclerotium rolfsii و از Termitomyces جدا شده اند. آنها ظاهراً در بیشتر قارچ های فاسد قهوه ای غایب هستند. همچنین ژنوم های پاتوژن انسانی Cryptococcus neoformans و پاتوژن گیاه Ustilago maydis فاقد ژن های مربوطه هستند. فعالیت سلوبی هیدرولاز در قارچ های تجزیه کننده بستر و برخی از قارچ- ریشه های خارجی نیز ثبت شده است. آنزیم ها با توده های مولکولی به طور معمول بین ۵۰ تا ۶۵ کیلو دالتون می باشد اما Dichomitus squalens و Sclerotium rolfsii cellobiohydrolases کوچکتر هستند. Papain از خانواده ۷ سلوبی هیدرولازها دامنه بزرگی را فراهم می کند که در محیط کشت از نظر کاتالیستی فعال با بسترهای جرم مولکولی کم و CBD 4/5 کیلو دالتونی شبیه به تریکودرما رئیسی است.

آسکومیست ها و سلوبیوهیدرولاز

در داخل محیط کشت یک مدل ساختاری برای خانواده ۷ CBH58 از Phryerochaete chrysosporium در دسترس است. مشابه گلیکوزیلازها گلیکوزیلاسیون سلوبی هیدرولازها کم یا پایین است. o12٪ و نقاط ایزوالکتریک اسیدی هستند. به طور معمول بین ۳٫۶ و ۴٫۹ (اما در F. palustris فقط ۳٫۳ است). ضرورت حداقل دو سلولی هیدرولاز در آسکوسیت هیپوکره jecorina (آنامورف Trichoderma reesei) به اولویت خاص آنها برای کاهش (CBHI) و عدم تخلیه (CBHII) انتهای زنجیره سلولز نسبت داده شده است. این مفهوم در شرابط محیط کشت همچنین با هم افزایی اگزو-اگزو مشاهده شده بین این دو آنزیم پشتیبانی می شود. این همچنین دلیل احتمالی تعدد سلوبی هیدرولازهاست که در اکثر پایه های بنیادی که تاکنون مورد مطالعه قرار گرفته اند کشف شده است.

سلوبیوهیدرولاز سه تایی در قارچ ها

طبق ازمایش هایی که در محیط کشت سلوبیوهیدرولاز  صورت گرفته است، Phryerochaete chrysosporium سه سلوبی هیدرولاز، CBH58 (در ابتدا CBH I CBH62 و CBH50 تولید می کند. CBH58 و CBH62 سلوبیوز را از کاهش انتهای سلولز آزاد می کند و CBD های آنها در انتهای C قرار دارند در حالی که CBH50 از انتهای غیر منتقل می شود و CBD آن در انتهای N قرار دارد. همه ترکیبات Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolases عمل هم افزایی قابل توجهی نشان می دهد. مشابه اکثر اندوگلوسانازها اپتیمای کاتالیزوری سلوبی هیدرولازها در محدوده pH باریک بین ۴٫۰ و ۵٫۰ واقع شده اند. Optima دما بسته به آنزیم و بستر بین ۳۷ و ۶۰ درجه سانتیگراد است.

سلوبیوهیدرولاز ها روی سلولز کریستالی
سلوبی هیدرولازها در محیط کشت به طور معمول روی سلولز کریستالی فعال هستند. جالب اینجاست که CBH58 و CBH50 از Phryerochaete chrysosporium روی کربوکسی متیل سلولز و CBH62 و همچنین هر دو سلولوبیو هیدرولاز از Pleurotus ostreatus تنها فعالیت ضعیف در برابر این بستر نشان ندادند. از طرف دیگر CBHI و CBHII از Coniophora puteana هر دو بر روی سلولز آمورف فعال هستند. فقط آنزیمهایی که از انتهای کاهش استفاده می کنند قادر به آزادسازی سلوبیوز از pNPC یا p-nitrophenyl-b-D-lactoside (pNPL) هستند. مقادیر KM بین ۲ تا ۷ میلی متر است. سلوبی هیدرولازها همچنین بر روی سلولزای سلول سلولی تتراوز یا سلوکودکسترینهای بالاتر فعال هستند. جای تعجب نیست که سلوبیوز محیط کشت به عنوان یک مهار کننده رقابتی سلوبی هیدرولاز عمل می کند. Ki در Coniophora puteana 1.2-2.4mM است اما در کریسوسپوریوم Phanerochaete حداقل ۶۵ میلی متر است. پیشنهاد شده است که اثر مثبت سلوبیوز دهیدروژناز (CDH) بر هیدرولیز سلولز به دلیل تسکین در مهار محصول سلوبی هیدرولازها توسط اکسیداسیون سلوبیوز باشد.

Leave a comment

محیط کشت مناسب کشت جنین

نقش پیروات و لاکتات در محیط کشت رشد جنین

بلوک توسعه جنین های موش در شرایط آزمایشگاهی در مرحله ۲ سلولی با اختلاط لاکتات در محیط کشت غلبه کرد. بعداً نشان داده شد که پیرووات می تواند جایگزین لاکتات برای این منظور شود و تنها پیروات یا اگزالو استات می تواند به عنوان بسترهای انرژی توسط تخمدان موش ۱ بارور بارور شده استفاده شود. در حالی که یک وابستگی محدود کننده مشابه به بسترهای انرژی نیز ممکن است برای جنین همستر وجود داشته باشد ، این نمی تواند برای عدم موفقیت مراحل ۲- و ۴ سلولی ایجاد شود. زیرا هر دو پیروات (۰٫۵ میلی متر) و لاکتات (۱۰ میلی متر) در محیط کشت مناسب ما حضور دارند. متوسط. با این وجود ، این امکان وجود دارد که این مواد در غلظت بهینه تهیه نشوند. غلظت پیروات و لاکتات نشان داده شده است که برای optima مهم هستند! رشد جنین موش. این احتمال بررسی خواهد شد ، اما بعید به نظر می رسد تهیه پیروات و لاکتات در کمتر از اپتیما! غلظت می تواند به طور کامل برای عدم موفقیت جنین های همستر ۲- و ۴ سلولی در شکاف در محیط است.

مطالعه جنین هایی غیر از موش
مطالعات روی جنین گونه هایی به غیر از موش که ظاهراً نیازهای دقیق تری برای رشد روی محیط کشت در شرایط آزمایشگاهی دارند، ممکن است عوامل محیطی را که برای رشد اولیه حیاتی هستند نشان دهد. همستر طلایی ممکن است یکی از چنین حالت هایی باشد. تظاهرات ما در مورد نیاز جنین های همستر اولیه ۸ سلولی برای اسیدهای آمینه خاص ، که مورد نیاز جنین موش نیستند ، می تواند گامی در جهت درست باشد. واسطه ای که در مطالعه حاضر برای کشت جنین های همستر (TALP و اسیدهای آمینه) مورد استفاده قرار گرفته است ، همچنین در آزمایشگاه ما برای کشت تخمک های میمون حاصلخیز لقاح آزمایشگاهی آزمایشگاهی به مرحله ۱۶ سلولی استفاده می شود (در مرحله آماده سازی). از آنجا که جنین های همستر ۲- و ۴ سلولی به ندرت در هر صورت در محیط کشت کشت جنین TALP ما حاوی اسیدهای آمینه شکسته می شوند ، بدیهی است که برخی از فاکتورهای دیگر یا تعدیل این محیط برای رشد این مراحل لازم است. هنگامی که این عامل (یا عوامل) کشف شد ، ممکن است اثبات شود که در محیط جنین زودرس سایر گونه ها نیز سودمند است. آزمایشات در حال حاضر در حال انجام است تا ماهیت این عامل را روشن کند.

انتقال جنین های کشت شده به ماده ها
تلاشهای ما برای نشان دادن قابلیت زنده ماندن بلاستوسیستهای کشت شده روی محیط کشت نیکورایی از مرحله ۸ سلولی با انتقال جنین به زنان شبه حامل با موفقیت محدود روبرو شد. تقریبا نیمی از ۷۱ جنین منتقل شده اما بسیاری از این موارد بعداً مورد تحلیل قرار گرفتند. با این حال ۵ فرزند در پی این مراحل انتقال جنین متولد شدند. اگرچه ناهنجاری در جنین های کشت شده تا حدودی می تواند مسئول از بین رفتن جنین باشد باید چندین عامل بالقوه مهم دیگر در نظر گرفته شود. یک عامل اصلی نیاز به هماهنگ سازی دقیق جنین و گیرنده است زیرا همستر مانند کاشت موش کشت شده در محیط کشت حیوانی تاخیری را نشان نمی دهد. برخی از گیرندگان استفاده شده است که با اهدا کنندگان جنین هماهنگ شده است. از آنجا که کار در گونه های دیگر نشان می دهد که رشد جنینی در شرایط in vitro ممکن است در مقایسه با جنین هایی که به طور کامل در داخل بدن در حال رشد هستند عقب مانده باشد بلاستوسیستهای کشت منتقل شده ممکن است با رحم گیرنده ناهمگام باشند. این امر می تواند چشم انداز موفقیت آمیز کاشت و یا رشد جنین را کاهش دهد.

تاثیر زمان انتقال جنین در موفقیت بارداری

هنگامی که شرایط بهینه محیط کشت یافت می شود که می تواند از رشد کامل جنین در مرحله قبل از پیوند حمایت کند. عقب ماندگی جنین های کشت یافته ممکن است به میزان قابل توجهی کاهش یابد. هماهنگ سازی دقیق مورد نیاز برای کاشت در همستر در واقع ممکن است به عنوان یک مزیت در نظر گرفته شود زیرا نتایج به دست آمده با استفاده از این مدل ممکن است برای انواع گسترده تری از پستانداران نسبت به داده های به دست آمده با موش کاربرد داشته باشد. استفاده ما از خانمهای گیرنده که ۲۴ ساعت بعد از اهدا کنندگان جنین جفت شده بودند باعث افزایش لانه گزینی موفقیت آمیز نمی شود. این ممکن است به دلیل جبران بیش از حد مشکل همگام سازی بعد از محیط کشت باشد. یعنی جنین ها در مقایسه با رحم گیرنده خیلی پیشرفته بودند. آزمایشات در حال انجام است تا مشخص شود که آیا استفاده از گیرنده هایی که تحت شرایط روز معکوس نگهداری می شوند که ممکن است با جنین های کشت بهتر هماهنگ باشد. موفقیت انتقال جنین را بهبود می بخشد. سایر دلایل احتمالی عدم وجود لانه گزاری موفقیت آمیز جنین های کشت یافته مکانیکی (از بین رفتن جنین یا آسیب در حین انتقال) و تعداد ناکافی جنین های زنده برای حمایت از بارداری است. در ۵ مورد از ۶ بارداری شکست خورده. در هر گیرنده ۵ یا کمتر کاشت موفقیت آمیز وجود داشت. در حال حاضر آزمایشاتی انجام می شود که جنین های ۸ سلولی به طور مستقیم و بدون محیط کشت جنین از اهدا کنندگان به گیرنده های هماهنگ منتقل می شوند تا اطلاعاتی در مورد عوامل مهم برای انتقال موفقیت آمیز جنین در همستر کسب کنند.

Leave a comment

محیط کشت جنین همستر

اووا از همستر طلایی به راحتی در شرایط آزمایشگاهی در محیط کشت قابل لقاح است. از زمان این کشف گامتهای همستر توسط محققان بی شماری برای بررسی جزئیات لقاح و وقایع مرتبط با آن (ظرفیت اسپرم و واکنش آکروزوم) در شرایط آزمایشگاهی استفاده شده است. از چندین جنبه مهم سیستم لقاح همستر در شرایط ازمایشگاهی یکی از مدلهای مفیدی است که ما برای مطالعه تعامل گیمت پستانداران داریم.

بررسی موفقیت جنین دو سلولی
با استفاده از یک محیط کشت جنین مبتنی بر محلول Tyrode استفاده شده است. شواهد مورفولوژیکی باروری تقریباً ۹۰٪ تخمک های همستر تلقیح آزمایشگاهی را نشان می دهد. حداکثر ۹۰٪ تخمکهای لقاح آزمایشگاهی می توانند یک بار در کشت تقسیم شوند تا ۲ درجه تولید کنند. جنین هایی که با بررسی میکروسکوپی نوری از نظر مورفولوژیکی طبیعی به نظر می رسند. هیچ شکاف دیگری از چنین جنین ها رخ نمی دهد، از این رو ظرفیت توسعه تخمک های همستر لقاح آزمایشگاهی در محیط کشت جنین همستر را نمی توان مشخص کرد. جنینهای ۲ سلولی همستر که از زنان جفت شده بهبود می یابند نیز در شرایط آزمایشگاهی نتوانند از بین بروند. هیچ گزارشی در مورد موفقیت آمیز بودن سلول ۲ سلول همستر منتشر نشده است. یا جنین ۴ سلولی. اگر این “بلوک ۲ سلولی” از بین برود سودمندی همستر در سیستم لقاح آزمایشگاهی به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. علاوه بر این توانایی به دست آوردن توسعه کامل قبل از پیوند (زایگوت به بلاستوسیست) جنین همستر در شرایط آزمایشگاهی می تواند علاوه بر ارزشمندی از مدلهای حاضر برای مطالعه رویان شناسی اولیه پستانداران باشد.

بررسی موفقیت جنین های ۸ سلولی
جنینهای ۸ سلولی همستر کشت شده روی محیط کشت که از زنان جفت شده بهبود یافته اند ، در محلول اصلاح شده Tyrode به مرحله بلاستوسیت کشت داده می شوند ، و پیشرفت بسیار کمتری در رسانه های معمولی Kreb’s-Ringer-bicarbonate معمولی که برای جنین موش استفاده می شود انجام می شود. تعداد بسیار کمی از جنین همستر کشت شده پس از انتقال به گیرندگان ایجاد شده است. ماهیت این تفاوت مشخص نیست. شناسایی اجزای خاص محیط کشت که برای تداوم رشد جنین های همستر مهم هستند ، ممکن است اطلاعات قابل استفاده در مورد جنین سایر گونه های پستانداران را فراهم آورد ، که اغلب در مراحل موفقیت آمیز کشت از مراحل اولیه شکاف دشوار است.

کشف مدل جدید برای بررسی اولیه پستانداران

در این مطالعه جنین همستر ۸ سلولی به یک مرحله بلاستوسیست در یک محیط کشت رشد یافته برای لقاح همستر تخم مرغ رسیده است. بعضي از جنين هاي كشت شده تا مرحله بلاستوسيست كشت داده شده بودند. همانطور كه ​​توسط زايمان هاي جوان طبيعي پس از انتقال جنين نشان داده شده است. این نتایج بخشی از برنامه با هدف دستیابی به توسعه کامل قبل از پیوند جنین های همستر در شرایط آزمایشگاهی از مرحله زایگوت تا بلاستوسیست (B4) است. تکمیل این برنامه می تواند یک مدل جدید با ارزش برای بررسی رشد اولیه پستانداران فراهم کند. در اکثر آزمایش های توصیف شده در مطالعه حاضر جنین های داخل محیط کشت از همسترهای زنانه تخلیه شده به دلایل بارز اقتصادی و طراحی آزمایشگاهی بدست آمده است. اگرچه می توان ادعا كرد كه نیاز محیط برای جنین به دست آمده از این طریق می تواند متفاوت از جنین های بدست آمده از تخمك گذاری طبیعی باشد اما دلیلی بر این باور نیست كه شاید این مورد باشد. سایر محققان نشان داده اند كه تخمدان همستر فوق تخمك زده شده در داخل بدن بارور می شود و در داخل بدن از رشد عادی استفاده می شود. ویژگیهای جنین همستر را رشد موفقیت آمیز در مرحله مرحله ۸ سلولی را محدود می کند و بنابراین ممکن است برای مراحل اولیه توسعه نیز مهم باشد.

جنین های ۸ سلولی اولیه و نهایی
بارزترین ویژگی توانایی رشد افتراقی در محیط کشت جنین توسط جنین های ۸ سلولی زودرس و اواخر است. تنها ۲٪ از جنین های اولیه ۸ سلولی قادر به ایجاد بلاستوسیست در محیط غیراصولی (TALP) بودند.در حالی که ۲۲٪ اواخر ۸ سلولی بود. جنین از این نتایج استنباط می شود که تغییر مهمی در توانایی های متابولیکی جنین های پیش از بغل موش بزرگ در مرحله ۸ سلولی اتفاق می افتد. این تغییر در برخی از جنین بین ۵۴ ساعت و ۶۲ ساعت پس از فعال شدن تخم رخ می دهد. کشف ماهیت این تغییر می تواند اطلاعات ارزشمندی در مورد علت بلوک توسعه مشاهده شده در مراحل جنینی قبلی در محیط کشت همستر ارائه دهد. نتایج ما همچنین نشان می دهد که پیشرفت جنین های اولیه ۸- سلول به شدت وابسته به حضور اسیدهای آمینه در محیط است. نسبت درصد جنین ها در حضور و در صورت عدم وجود اسیدهای آمینه در حال رشد ۱۸: ۱ بود.

نقش اسید آمینه در رشد جنین کشت شده

اسیدهای آمینه رشد مراحل اولیه و اواخر ۸ سلولی را به همان میزان افزایش داده است. در حضور اسیدهای آمینه در محیط کشت جنین همستر ۳۴٪ اضافی از جنینهای اولیه ۸ سلولی در مقایسه با پاسخ در محیط غیرمستقیم به بلاستوسیستها تبدیل می شوند ، و ۴۴٪ دیگر از جنین های اواخر ۸ سلولی تحت شرایط مربوطه.این مقادیر بسیار مشابه هستند. بنابراین هیچ تفاوت واقعی در پاسخهای مشاهده شده به اسیدهای آمینه از ۲ گروه جنین وجود ندارد. با توجه به تظاهرات ما از یک نیاز تا جنین ۸ سلولی اولیه به نظر می رسد که جنین برای همان اسیدهای آمینه داخل محیط کشت برای بلوغ تخمک همستر ضروری است. به نظر می رسد که مراحل متوسط ​​رشد (۱ سلولی از طریق جنین ۴ سی دی) نیز این نیاز را نشان می دهد. وابستگی به این اسیدهای آمینه ممکن است یکی از عوامل مؤثر در بلوک ۲ سلولی در رشد در شرایط آزمایشگاهی باشد. اما عوامل یا شرایط دیگر باید دخیل باشد زیرا تعداد کمی از جنین های ۴ سلولی (۴٪) که در بلاستوسیست ها در اسید آمینه تکمیل شده اند باید درگیر شوند. محیط کشت و جنینهای ۲ سلولی به هیچ وجه در این محیط شکاف ندارند. تلاش های ما برای افزایش نسبت جنین های اولیه ۸ سلولی در حال توسعه به بلاستوسیست ها با اضافه کردن مکمل ویتامین MEM Eagle به و با تغییر pH یا فشار اسمزی محیط ناموفق بودند. جنین ۸ سلولی همستر به نظر می رسد قابل تحمل به تغییرات در pH و اسمولاریته است.

مقایسه رشد جنین موش و جنین همستر در محیط کشت ها

مشاهدات فوق روی محیط کشت از چندین جنبه متفاوت از مواردی است که توسط چندین محقق گزارش شده با استفاده از جنین قبل از پیدایش اندام ها از موش که به طور گسترده به عنوان مدل برای مطالعه توسعه اولیه استفاده می شود متفاوت است. تأثیر واضح فشار اسمزی بر رشد جنین های موش در فرهنگ نشان داده شده است. با دامنه بهینه کاملاً تعریف شده. اثر برجسته pH بر رشد جنین موش توسط برینستر نشان داده شد. در محدوده بهینه برای این متغیرها جنین های موش به آسانی به مرحله بلاستوسیست در محیط کشت های شیمیایی تعریف شده ساده و حاوی BSA و منابع انرژی مناسب می رسند. یا حتی در یک رسانه متوسط ​​فاقد آمینو اسیدها و BSA. بنابراین جنین موش نسبت به ترکیبات شیمیایی محیط آن بسیار تحمل می شود. از این نظر موش ممکن است الگویی ایده آل برای ارائه اطلاعات مربوط به توسعه قبل از پیدایش اندام ها قابل استفاده برای پستانداران به طور کلی باشد. جنین های اکثر گونه های پستانداران مورد مطالعه قرار گرفته اند از جمله همستر (مطالعه حاضر)، سایر حیوانات آزمایشگاهی و گونه های حیوانات اهلی برای رشد در محیط کشت بسیار دشوارتر به نظر می رسند. در اکثر گزارش های منتشر شده ، فقط با رشد بسیار کمی جنین های اولیه این گونه ها با استفاده از انواع محیط های کشت به نظر می رسد که برای رشد جنین های موش مناسب هستند.

Leave a comment

کفیر چیه

تقاضا برای محصولات لبنی تخمیر شده عملکردی مانند کفیر در سال های اخیر افزایش یافته است زیرا مصرف کنندگان به طور فزاینده به محصولات با کیفیت بالاتر علاقه مند هستند. بنابراین چندین فرآورده های لبنی تخمیر شده مانند کفیرشیر  مطالعات متعددی به دنبال ارزیابی ویژگی های عملکردی آنها بوده است.  جایی که اینها به فعالیت بیولوژیکی میکروارگانیسم های مورد استفاده در تولید محصولات مربوط می شود. کفیر یک محصول کاربردی محسوب می شود و بنابراین ، می تواند تأثیرات مفیدی بر سلامت افراد بگذارد. میکروارگانیسم های موجود در ترکیب آن توانایی کمک به تعادل میکروبی روده را دارند و با اثرات مفیدی مانند ضد میکروبی، ضد توموری و ضد سرطان زایی مرتبط بوده اند ، علاوه بر بهبود هضم لاکتوز به دلیل وجود آنزیم β-galactosidase است. رشد مداوم تقاضا برای لبنیات در چندین کشور منجر به افزایش تعداد صنایع لبنی شده است. این میزان تولید بالاتر نگرانی بیشتری راجع به حجم بیشتری از زباله های صنعتی تولید شده در طی فرآوری ایجاد کرده است.

کفیر محصولی فرعی از تولید ماست بومی
در برخی موارد این فرآورده های فرعی مانند کفیر چیه توسط صنایع ضعیف استفاده می شوند و به منظور تصفیه مناسب به کارخانه های تصفیه خانه فاضلاب هدایت نمی شوند. بنابراین برای جلوگیری از آسیب های زیست محیطی و همچنین بهره گیری از مواد مغذی مهم تحقیقات متعددی برای یافتن گزینه های استفاده از این ضایعات انجام شده است. از جمله فرآورده های فرعی تولید شده در صنایع لبنی کره ماست است که باقیمانده حاصل از تولید کره به دست می آید و ترکیبی شبیه به شیر بدون چربی دارد. به دلیل بار ارگانیک زیاد کفیر از نظر زیست محیطی به صنعت لبنیات تبدیل شده است. بنابراین استفاده مجدد از این فرآورده توسط صنعت از اهمیت بالایی برخوردار است که می تواند به دلیل ارزش غذایی آن ، در قالب چندین محصول به ارزش اقتصادی بیفزاید و همچنین در کاهش آلودگی محیط زیست نقش داشته باشد.

پاستوریزاسیون معمولی کفیر
بیشتر پروانه های روغنی حاصل از صنایع از طریق فرآیند پاستوریزه کردن غلظت و خشک کردن معمولی کفیر به پودر تبدیل می شوند. با این حال برای صنایع کوچک که منابع مالی لازم برای خرید تجهیزات خشک کردن و سرمایه گذاری بیشتر در سیستم های تصفیه خانه فاضلاب را ندارند ، گزینه های ساده تر فناوری برای استفاده از پروانه مهم هستند. استفاده از کره از کره برای ساخت محصولاتی از جمله نوشیدنی ها و پنیرها و به عنوان یک ماده دیگر محصولات جایگزین بسیار خوبی است زیرا قیمت کم در دسترس بودن زیاد خواص تکنولوژیکی خوب و ویژگی های حسی مطلوبی را ارائه می دهد. در این زمینه مطالعاتی که در مورد استفاده از کره ماست در تولید و پذیرش نفسانی کفیر چیه ارزیابی می شود کمیاب است. این جایگزین به دلیل کمبود پیچیدگی فرآیند تولید از اهمیت بالایی برخوردار است و در صنایع کوچک نیز قابل استفاده است.

Leave a comment

تریکودرما کاهنده مقاوم شدن بیمارگرها

اهمیت تریکودرما در اینجاست که جمعیت جهانی ۹٫۱ میلیارد نفری که در سال ۲۰۵۰ محاسبه شد نیاز به افزایش تولید کلی مواد غذایی تا حدود ۷۰٪ دارد. افزایش قابل توجه تولید دانه های غذایی طی سالیان متمادی به رفع نیازهای امنیتی مواد غذایی کشور کمک کرده است. اما تعداد استرس های زیست زا و غیر زنده باعث می شود تا حد زیادی تلفات محصول کاهش یابد. محدودیت های زیست محیطی شامل قارچ ها (به غیر از گونه های مفید مانند تریکودرما)، باکتری ها، ویروس ها، علفهای هرز، نماتد و حشرات است که باعث از بین رفتن عملکرد تا ۳۱-۴۲٪ می شود. بنابراین مصرف سموم دفع آفات نیز سال به سال افزایش می یابد. زیرا ۴۵٫۳۹ هزار تن سموم دفع آفات در سال ۲۰۱۲-۱۳۳ مصرف شده است.

سموم شیمیایی مقاومت بیمارگر ها را سال به سال افزایش می دهند

اهمیت دیگر تریکودرما کاهنده مقاوم شدن علاوه بر تأثیر محیط و موجودات غیر هدف استفاده مداوم و فوق العاده از سموم دفع آفات شیمیایی باعث ایجاد فشار بالای انتخابی بر روی عوامل بیماری زا می شود که به جهش درون پاتوژن ها و ایجاد نژادهای مقاوم به سموم دفع آفات از جمله دودین و مقاومت در برابر متالاکسیل در قارچ ونتوریا انه کوآلیس عامل لکه سیاه سیب و فایتوفتورا اینفستنس به ترتیب تأثیر می گذارد. مقاومت در برابر سموم دفع آفات و تهدیدات محیطی به دلیل استفاده گسترده از سموم دفع آفات شیمیایی برای مدیریت بیماری از معرفی جایگزین جدید به عنوان کنترل بیولوژیکی استفاده می کند. استفاده از کودهای بیولوژیکی تریکودرما و بیولوژیکها جایگزین برای پایداری تولید زیاد با تأثیر اکولوژیکی کم است. علاوه بر قارچ های میکرووریکی کلاسیک و باکتری های ریزوبیوم سایر قارچ های تقویت کننده رشد گیاهان از قبیل تریکودرما کاهنده بیمارگرها که فرم جنسی آن هایوکرئا می باشد با سرکوب بیماریهای گیاهی می تواند رشد گیاه را تحریک کند. عوامل کنترل بیولوژیکی شامل تعدادی قارچ است و ۹۰٪ چنین کاربردهایی از سویه های مختلف Trichoderma انجام شده است که خصوصیات آنتاگونیستی آنها بر اساس فعال سازی مکانیسم های متعدد استوار است. کنترل بیولوژیکی یکی از مؤلفه های اصلی مدیریت یکپارچه آفات است که علاقه زیادی را در بین کشاورزان برای مدیریت بیماری های زیست محیطی و پایدار ایجاد کرده است. جنس تریکودرما دارای ویژگیهای کنترل بیولوژیکی معقول متعلق به گونه T. Harzianum ،T. resseyi ، T. asperellum ،T. viridae ،T. virense می باشد.

تریکودرما و محل زندگی آن

گونه های تریکودرما اجزای فراگیر و غالبا غالب مایکوفلورا در خاک، بستر، مواد آلی و اکوسیستم ریزوسفر در تمام مناطق آب و هوایی به عنوان ساپروفیت ها هستند. اکتشافات اخیر نشان می دهد که این قارچ ها فرصت طلب، سمبل گیاهان هراسان  و همچنین انگل سایر قارچ ها هستند. گونه های Trichoderma آندوفیتها استعمارهای مستحكمی و ماندگار سطوح ریشه را ایجاد كرده و به اپیدرم نفوذ می كنند. با این حال  توانایی این قارچها در حس، حمله و از بین بردن سایر قارچها عامل اصلی محرک موفقیت تجاری آنها به عنوان بیولوژیکها است. تریکودرما از تأثیر مستقیم و غیرمستقیم گیاهان بر تعامل محیط پالنت پاتوژن و خاک دفاع می کند. این قارچ ها نه تنها از طریق کشتن عوامل بیماری زا بطور عمده سایر قارچ ها و نماتد ها از گیاهان محافظت می کنند بلکه باعث مقاومت در برابر عوامل بیماری زای گیاه می شوند تحمل استرس غیر جاندار، رشد و نمو گیاه را بهبود می بخشند. جذب مواد مغذی و تجمع بیولوژیکی فلزات سنگین و آلاینده های محیطی می شوند. علاوه بر این این جنس شامل قارچ هایی است که متابولیت های ثانویه با اهمیت بالینی و آنزیم هایی با کاربرد صنعتی گسترده تولید می کنند. تریکودرما کاهنده بیمارگرها انواع مختلفی از ترکیبات را ایجاد می کنند که واکنش های موضعی یا سیستمیکی را تحریک می کنند. این تعامل ریشه و میکروارگانیسم ها باعث ایجاد تغییرات چشمگیر در متابولیسم گیاه می شوند. گیاهان در برابر پاسخهای شبیه به مقاومت اکتسابی سیستمیک و مقاومت سیستمیک ناشی از ریزوباکتریها از بسیاری از عوامل بیماری زا محافظت می شوند.

استعمار ریشه توسط Trichoderma

همچنین قارچ تریکودرما غالباً رشد و نمو ریشه، بهره وری گیاهان، جذب و استفاده از مواد مغذی و مقاومت در برابر تنش های زنده و غیر زنده را تقویت می کند. مطالعه مفصل در مورد نحوه تکامل این میکروارگانیسم در تعامل با سایر قارچ ها و گیاهان باعث بهبود و گسترش کاربردهای آنها در برنامه کنترل بیولوژیکی خواهد شد. توانایی حمله به پاتوژنهای گیاهی حاصل از خاک سالها بر علاقه به Trichodermaحاکم بود. از سالهای گذشته محققان علاقه خود را به مقاومت در برابر بیماری های گیاهی به عنوان [مقاومت سیستمیک القا شده (ISR) نشان می دهند. تا حدودی مقاومت به دست آمده سیستمیک (SAR)] ناشی از همزیستی ریشه تریکودرما.

قارچ کش تریکودرما موفق ترین قارچ کش بیولوژیک در کشاورزی دنیا

قارچ کش های بیولوژیک تریکودرما موفق ترین در كشاورزی موجود است زیرا بیش از ۶۰٪ از بیوكسیكسیدهای ثبت شده در سرتاسر جهان از فرمولاسیون های مبتنی بر تریكودرما وارد شده اند. فقط در هند ، حدود ۲۵۰ محصول برای کاربردهای مزرعه در دسترس است اما درصد سهم از قارچ کش های زیستی تنها بخش کوچکی از بازار قارچ کش ها است و تحت سلطه آن توسط مواد شیمیایی مصنوعی است. اشکال عمده قارچ کش های زیستی تریکودرما عمل کندی است و تحت تأثیر عوامل محیطی قرار دارد. از این رو کارآیی آنها در شرایط مزرعه محدود است. در اینجا “دستکاری ژنتیکی” برای طراحی سویه های جدید موثرتر از بومی ممکن است مفید باشد. این امر می تواند با به دست آوردن دانش در مورد مکانیسم های مولکولی تعامل این ارگانیسم ها با سایر عوامل زنده و غیر زنده باشد.

Posted on Leave a comment

محیط کشت فیتوپلانکتون

مطالعات فیزیولوژی فیتوپلانکتون های دریایی با توانایی ما در پرورش آنها در رسانه های مصنوعی بسیار تسهیل شده است. توسعه چنین رسانه هایی با تحقیقات پیشگامانه مایکل (۱۹۸۹-۱۹۸۳) در مورد غنی سازی مواد مغذی و با کار آلن و نلسون (۱۹۱۰) در رسانه های دریایی مصنوعی سرچشمه گرفت. این دستور العمل های رسانه های مصنوعی در دوره مدرن عمدتاً با تلاش های گیلارد ، دورپ ، مک لوگلین ، Provasoli و همکارانشان اصلاح شده است ، و اکنون قادر به حمایت از رشد اکثر جلبک های پلانکتونی هستند. بهترین و معروف ترین و پرکاربردترین دستور العمل غنی سازی مواد مغذی ، غنی سازی “f” است که به طور معمول با استفاده از نیمه مقاومت (f / 2) گیلارد و رایتر (۱۹۶۲) استفاده می شود. پیشرفت قابل توجه در توسعه رسانه های مصنوعی ، افزودن ویتامین ها و مواد کلاتی کننده به جای عصاره های خاک تعریف نشده، بود. معرفی عوامل چلات کننده مصنوعی ، به ویژه EDTA ، در رسانه های کشت جلبک توسط هاتنر (هاتنر و همکاران ۱۹۵۰) به محققان این امکان را داد تا شیمی فلزات ردیابی را تعریف کنند و اساس کلیه کارهای مدرن در زمینه فیزیولوژی فلزات ردیابی فیتوپلانکتون را فراهم می کند. با توجه به آزمایشاتی که نشان دهنده تحریک رشد فیتوپلانکتون در آبهای اقیانوسی با افزودنی های آهن است ، علاقه به ردیابی فلزات ردیابی فیتوپلانکتون دوباره احیا شده است (Subba Rao and Yeats 1984؛ Martin and Fitzwater 1988). مکانیسمهای دقیق بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی که توسط آنها فیتوپلانکتون با محدودیت فلز سازگار می شود و از آهن یا سایر محدودیت های فلزات ردیابی می شود ، مشخص نیست و نیاز به کشف است. بدیهی است که فرضیه های دقیق مکانیکی و تکنیک های جدید برای ارزیابی محدودیت فلز در دریا از آزمایش های دقیق آزمایشگاهی ناشی می شوند.

چند سال پیش گروه تحقیقاتی ما با همکاری R. R. L. Guillard محیط آبزیان تعریف شده آبزیان را برای استفاده در مطالعات فلزات ردیابی فیتوپلانکتون توسعه دادند (مورل و همکاران ۱۹۷۹). نیاز به چنین واسطه ای بوجود آمد زیرا آشکار شد که در دسترس بودن بیولوژیکی و سمیت فلزات اثرگذار با خاصیت شیمیایی آنها ، بویژه با فعالیت های یون آزاد آنها تعیین می شود (ساندا و گیلارد ۱۹۷۶ ؛ اندرسون و مورل ۱۹۷۸). بنابراین ، کنترل و دستکاری مشخصات فلزات ردیابی برای تحقیقات فلزات فیتوپلانکتون-ردیابی حیاتی بود. همانطور که ما طی چند سال گذشته میزان استفاده از فلزات ردیابی و سمیت موجود در فیتوپلانکتون های دریایی را مورد مطالعه قرار دادیم ، ما شروع به بهبود درک نظری و عملی خود در مورد کشت فیتوپلانکتون تحت انواع محدودیت های فلزی کردیم. تجربیات ما ممکن است برای دیگران که قصد مطالعه ردیابی تغذیه فلزی فیتوپلانکتون را دارند مفید باشد. هدف اول ما توصیف تغییرات پروتکل اصلی و ارائه تکنیک هایی است که اکنون در آزمایشگاه ما برای تهیه Aquil استفاده می کنیم. ما همچنین می خواهیم در مورد پیشرفت های اخیر در درک ما از شیمی متوسط ​​و اینکه چگونه این ممکن است در تحقیقات فلزات ردیابی فیتوپلانکتون تأثیر بگذارد ، بحث کنیم.

ترکیب و آماده سازی متوسط
مانند سایر رسانه های کشت مصنوعی ، Aquil از نمک های درجه رجنتس تهیه شده است ، به گونه ای ترکیب می شود که از عناصر معدنی آب دریا طبیعی بدون گلبوستوف آلی محلول ناشناخته استفاده شود. سنتز آن به سه بخش تقسیم می شود: (۱) آماده سازی چلکس ، (۲) آماده سازی متوسط ​​و (۳) عقیم سازی و دستکاری. این مراحل در تهیه Aquil در بخش های بعدی به تفصیل بیان شده است. برای از بین بردن آلاینده های فلزی غیرمستقیم موجود در مواد شیمیایی درجه تجزیه و تحلیل شونده مورد استفاده در تهیه Aquil ، جزء آب مصنوعی اقیانوس (SOW) و سایر مواد مغذی دیگر ، به استثنای غنی سازی فلزات ویتامین و EDTA ، از طریق ستون حاوی رزین تبادل یونی. رزین ، چلکس ۱۰۰ (مش ۲۰۰-۴۰۰ ؛ آزمایشگاههای Bio-Rad ، ریچموند ، کالیفرنیا) ، از یک ماتریس استایرن دیوینیل بنزن مشتق شده با ویژگی های ایمینودایستات تشکیل شده است که ترجیحاً یک کللیت را با فلزات انتقال (مثل آهن ، مس ، روی) مشتق می کنند. ، Ni ، Cd ، Co) ، در نتیجه آنها را از محلول خارج می کند زیرا محیط از طریق ستون نفوذ می کند. با این حال ، قبل از استفاده از آن ، رزین را باید با دقت درمان کرد تا مواد آلی که ممکن است از ستون خارج شود و در حالت آماده سازی جمع شود ، خارج شود. این ترکیبات به احتمال زیاد شامل ایمینودایستات رایگان بوده و بنابراین لیگاندهای اتصال دهنده فلزی قوی هستند. در حقیقت ، هنگامی که مس از ستون تازه آماده چلکس به Aquil اضافه می شود ، حضور آنالیز کننده های قوی با تجزیه و تحلیل آمپرومتری تشخیص داده می شود (شکل ۱). تصفیه بیشتر Chelex اثبات قابل اندازه گیری از این مواد اتصال دهنده فلز را از بین می برد. حضور این ماده اتصال دهنده فلز قابل جدا شدن نه تنها منحنی های تیتراسیون فلز را مختل می کند ، بلکه رشد جلبک ها را نیز مهار می کند. ما مشاهده كرديم كه در محيط Aquil تحت درمان با Chelex ناخوشايند ، كه در اصل حاوي w-zo.6 M يا ۱۰/۱۹ · ۶ M یون آزاد آهن است ، سرعت رشد Thalassiosira weissflogii به ترتيب تنها ۰٫۴۱ يا ۱٫۰۶ d-1 است.
با این حال ، هنگامی که این محیط با تابش اشعه ماوراء بنفش تابش می شود تا مواد آلی اکسیداسیون شود ، حداکثر سرعت رشد ۱٫۴۴ و ۱٫ ۸۵ d-1 مشاهده می شود. توجه كنید كه تأثیر مواد اتصال دهنده فلز در شرایط كم آهن (PFe = 20.6) برجسته تر است زیرا پیچیدگی آن در دسترس بودن آهن برای رشد را محدود می كند. برای جلوگیری از این مشکلات احتمالی ، ما یک روش شستشوی دقیق تر برای چلکس ۱۰۰ را نسبت به آنچه در دستور العمل اصلی Aquil پیشنهاد شده است ، اتخاذ کرده ایم. این پروتکل به طور موثری لیگاندهای اتصال دهنده فلز را از رزین جدا می کند (جدول ۱). ستون SOW باید بیشتر از ستون مواد مغذی تغییر یابد زیرا در گذشته ناخالصی های فلزی کمتری وجود دارد. شستشوی ۳ M NH40H در مرحله ۴ به طور هم زمان غلظت بالایی از NH4 در رزین را معرفی می کند. اگر رزین کاملاً شستشو شود ، غلظت NH4 + در آب دهنده می تواند به راحتی به سطح پس زمینه کاهش یابد (<0.1 t-tM).

Leave a comment

محیط کشت جلبک میکرو دریایی

محیط کشت COMBO برای تهیه یک ماده آب شیرین تعریف شده مناسب برای کشت هر دو جلبک و دافنیید ساخته شد. تعدادی از انتخاب ها در آهنگسازی COMBO انجام شد و استدلال را در اینجا شرح می دهیم. عناصر اصلی شامل هفت یون اصلی آب شیرین طبیعی (Ca2C، Mg2C ،NaC ،KC ،HCO3- ،SO4 2− و Cl−) و همچنین عناصر اصلی مواد مغذی (N ،P ،Si ،B) داخل محیط کشت می باشد. غلظت این عناصر همانند محیط گیلارد است. تفاوت در ترکیب عناصر از فراکویل به شرح زیر است: فراکویل تنها ۲۰٪ K و Na، تنها ۱۰٪ N ،۱۲٫۵٪ Si و B ندارد. اما ۲ برابر P اختلاف دارد. محیط ASM به شرح زیر است: دارای Na ،Cl و Mg بسیار بیشتر است.

مواد داخل محیط های تجاری و غیر تجاری مختلف

محیط کشت جلبک دریایی مقادیر مشابهی از Ca، دو برابر K ،P و N دارد اما فاقد مقادیر اضافی Si ،B و HCO3 – است. تفاوت آن با DYIII به شرح زیر است: DYIII دارای دو برابر Ca و یک سوم بیشتر منیزیم است اما سدیم پایین (فقط ۲۰٪) و K (فقط ۴۰٪) و مواد مغذی پایین (اما شامل Si و B) نیز دارد. محیط کشت دریایی زئوپلانکتون معمولی غلظت مواد مغذی اصلی کمتری را در مقایسه با محیط های کشت جلبکی دارند. غلظت عناصر سازنده در محیط COMBO برای کشت هر دو جلبک و زئوپلانکتون مناسب است. یک مورد مهم در ابداع محیط کشت جلبک COMBO نسبت Ca: Mg بود. بکر گزارش داد که جلبکها طیف گسترده ای از نسبت های Ca: Mg را تحمل می کنند. با این حال لیمن تعیین کرد که رشد دونوبریون سرتولاریا مطلوب است که نسبت مولی Ca: Mg 2: 1 بود. برای زئوپلانکتون نسبت مولی Ca: Mg از محیط MS برابر با ۳٫۲: ۱ و نسبت الندت و بیاز  به ۴: ۱ است که هر دو نسبت به سایر محیط کشت ها کمی بیشتر هستند. این محیط های آب سخت در اصل برای کشت Daphnia magna گونه ای سازگار برای زیستگاه های آب سخت طراحی شده بودند. همانند محیط کشت این و فراکویل نسبت مولی Ca: Mg از COMBO برابر ۱٫۷: ۱ است.

کشت دوگانه

از آنجا که محیط کشت COMBO در آزمایشگاه ما با فرهنگ D. magna و همچنین D. pulicaria و Ceriodaphnia dubia با موفقیت مورد استفاده قرار گرفته است ، ما دریافته ایم که نسبت مولی Ca: Mg از COMBO برای کشت دوگانه یک مجموعه گسترده از جلبک ها و زئوپلانکتون مناسب است. در آزمایش COMBO ، محققان دیگر نیز تولید مثل بسیار خوبی را توسط Daphnia pulex ، D. pulicaria ، D. galeata mendotae ، D. lumholtzi و D. magna گزارش داده اند و مهمتر اینکه این محیط کشت ها بیش از دو سال در COMBO حفظ شده اند (S. دودسون pers. com). سایر cladocera هایی که با موفقیت در COMBO پرورش یافته اند عبارتند از Bosmina longirostris (K. Schulz pers. com) و Diaphanosoma (R. Sterner pers. com.) و علاوه بر کلادوکران ها ، آزمایشگاه ما در COMBO نیز دارای پلاتاریا و روتیفرهای مختلط است.

تاثیر های مثبت و منفی رقیق سازی محیط کشت

برخی محققان اظهار داشته اند كه محیط کشت COMBO می تواند به همان اندازه مؤثر باشد كه ۵۰٪ با آب مقطر رقیق شود (S. Dodson pers. com) اما ما این رقیق سازی بستر کشت را برای گونه های آب سخت مانند D. magna توصیه نمی كنیم. غلظت K از COMBO (3.9 میلی گرم لیتر-۱) در محیط زئوپلانکتون کیتینگ (۱۹۸۵) (۹٫۸ میلی گرم L-1) و کمی بیشتر از آن در محیط کشت ابداع شده توسط الندت و بایاس (۱۹۹۰) بسیار پایین است. ۳/۳ میلی گرم لیتر در ۱). غلظت K پایین تر را انتخاب کردیم زیرا شناخته شده است که برای زئوپلانکتون مناسب است (یعنی الندت و بایاس ۱۹۹۰) ، و به اندازه کافی زیاد نیست که برای بیشتر جلبک ها سمی باشد. با این وجود ، کسانی که مایل به رشد گلبولهای طبیعی هستند ، می توانند نتایج لمن (۱۹۷۶b) را در نظر بگیرند که دریافتند K به سمیته داینوبریون بالاتر از ۵ میلی گرم لیتر از ۱ میلی گرم سمی تبدیل شده است. . com.) این گونه قبلاً با موفقیت در محیط کشت WC با نیمی از عناصر کمیاب معمولی و ۲۵ M P (کلوونز و گیلارد ۱۹۷۵) کشت داده شد. ما همچنین در COMBO گونه های بیشماری از سیانوباکتری ها ، Cryptophytes ، جلبک های سبز و دیاتوم ها را حفظ کرده ایم. در جدول ۵ حداکثر سرعت رشد جلبکهای انتخاب شده در محیط COMBO و شرایط کشت مربوطه ذکر شده است. جلبکهای دیگر شامل Staurastrum sp. ، Diogenes sp. ، Selenastrum sp. ، Cryptomonas ovata و Cryptomonas reflexa هستند. محققان دیگر از COMBO برای رشدChlamydomonas ، Selenastrum (S. Dodson ، pers. com.) ، Scenedesmus acutus (R. Sterner ، pers. com) و Chlamydomonas reinhardii استفاده کرده اند (K. Schulz ، pers. com). COMBO ثابت شده است که یک محیط کشت عالی برای آزمایشات دستکاری مواد مغذی و جلبک و زئوپلانکتون است (کیلام و همکاران ، ۱۹۹۷a ؛ کیلام و همکاران ، ۱۹۹۷ ب ؛ اروبه و همکاران ، ۱۹۹۷). زیرا P تحویل است.

چگونه میزان عناسر محیط کشت را دستکاری کنیم؟

از آنجا که در محیط کشت میکرو جلبک P به عنوان K2HPO4 تحویل داده می شود، هنگام کاهش غلظت فسفر COMBO برای استفاده در چنین آزمایشات دستکاری توصیه می کنیم غلظت K را با KCl (جدول ۱A) تکمیل کنید. Cl اضافه شده قابل توجه نیست. به همین ترتیب ، زیرا N به طور عمده به عنوان NaNO3 تحویل داده می شود. هنگامی که COMBO برای آزمایش های کم N آماده می شود ، سطح Na نیز پایین می آید ، اما مانند Cl ، این بعید است که مشکلی ایجاد کند (Becker 1994). عناصر ردیابی محیط کشت COMBO دارای دو عنصر عنصر کمیاب متفاوت است. عناصر کمیاب جلبک (ATE) شامل EDTA ، Fe و هفت عنصر جزئی هستند. عناصر کمیاب حیوانات (ANIMATE) شامل پنج عنصر جزئی جزئی دیگر است. از نظر كمبود و مسموميت براي برخي عناصر جزء محدوده محدودي وجود دارد و مطالعات دقيق تر در اين زمينه براي جلبك هاي آب شيرين مطلوب خواهد بود. یک راه حل مناسب برای عناصر کمیاب محیط کشت باید غلظت کافی را برای جلوگیری از محدودیت در زیست توده با جلبک زیاد فراهم کند. اما در زیست توده کم به سمیت نزدیک نشود.

مزیت و مشکلات جذب فلزات توسط جلبک ها

جلبک ها می توانند فلزات را تا حد زیادی متمرکز کنند (۱۰۰۰ برابر) با این حال غلظت بالای فلز در جلبک ها می تواند برای حیواناتی که آنها را می خورند مضر باشد. بنابراین باید بین کمبود و سمیت تعادل برقرار شود. مورل مخلوط عنصر کم ردیابی فراکول را طراحی کرد تا از نظر ترمودینامیکی میزان بارش مواد جامد در محیط کشت دریایی را کاهش دهد. اگرچه شرایط تعادل ترمودینامیکی باعث بارندگی می شود. میزان آنقدر پایین است که برای اهداف عملی مهم نیست. سطح EDTA (جدول ۲) همانند WC است (۱۱٫۷ M؛ Fraquil = 5.0 M؛ ASM و DY Ill از WC بالاتر هستند؛ کیتینگ بالاتر است و الندت و بیاس پایین تر است). نسبت شلات: فلز تقریباً ۲٫۴: ۱ به عنوان ایده آل پیشنهاد شده است (کلر و همکاران ، ۱۹۸۷). غلظت آهن همان مقدار در ASM ، پایین تر از WC (35٪) است ، اما کمی بیشتر از Fraquil ، DYIII ، یا محیط کشت های Keating (MS) یا Elendt و Bias (M-4) است. غلظت انتخاب شده یک سازش است ، زیرا آهن یک عنصر اصلی سوخت و ساز بدن است ، به خصوص برای سیتوکروم ها ، سنتز رنگدانه و متابولیسم نیتروژن. هفت عنصر جزئی مورد نیاز جلبک ها (ATE) areMn ، مس ، روی ، Co ، Mo ، Se و V هستند.